微生物培养基灭菌实验方法汇总2024/07/30

培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。灭菌的方法，通常可以分为四大类：1、加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；2、过滤去菌；3、射线灭菌和消毒；4、化学药剂灭菌和消毒。在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。1.干热灭菌法（即热空气灭菌法）干热灭菌一般是利用电热烘箱作为干热灭菌器。前面所包装好的玻璃器皿，如带棉塞的三角瓶，试管、包装好的吸管、培养皿等，放入电

实时荧光定量PCR技术实验准备与步骤2024/07/22

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。一、PCR实验前的准备:在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)1、DNA聚合酶。有许多商业DNA聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保

ELISA试剂盒中HRP底物使用操作步骤2024/07/15

ELISA试剂盒中HRP底物范围较广，HRP即辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以zui常用。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。HRP底物主要包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。一、二氨基联苯胺／金属盐DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更

细胞的冻存与复苏技术操作步骤2024/07/09

细胞的冻存与复苏技术操作步骤：一、原理在不加条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿

PCR反应条件温度和时间选择2024/07/01

PCR反应条件的选择技巧主要体现在温度、时间和循环次数上，温度过高，延伸时间不够都会对实验结果有很大的影响，以下总结方法技巧。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94

ELISA试验重点操作步骤阐述2024/06/28

酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是一种特殊的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体经济、普遍的试验诊断方法。ELISA试验重点操作步骤阐述如下：1、试剂的准备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，所有试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且

常见污染培养细胞的类型探究2024/06/12

由于缺乏机体免疫系统等的保护，体外培养的细胞没有对微生物的防御能力。在体外培养环境中，有些微生物在摄取营养物质方面有竞争优势，并在短时间内排出大量代谢产物；有些微生物则附着在细胞表面或进入细胞内部。因此，微生物污染会对体外培养细胞的正常生存、生长及功能活动造成极大干扰，严重的可致细胞死亡。同时，实验结果的准确性和可靠性也大打折扣。所以，保持细胞生存环境无微生物污染是体外实验的前提条件。良好的无菌操作可大大降低细胞培养中的微生物污染风险。微生物对细胞的影响因污染物和细胞种类的不同而表现各异，一般当

PCR引物是如何合成？2024/06/03

PCR引物合成是指通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。合成四步骤:第一步,是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯yi酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。第二步

细胞冻存实验重点干货分享2024/05/27

细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则，慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。一、原理当温度低至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止，低于-130℃时，细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保

ELISA试验常见标本收集介绍2024/05/20

酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术，在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，

蛋白质盐析法全方面分析2024/05/13

蛋白质通过盐析的办法沉淀的原理是降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。一．影响盐析的若干因素1．蛋白

各种细胞培养基类型概述2024/05/06

细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。常见的种类如下：1、无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素，细胞通常可耐受260mOsm/kg320mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES时需按以下方法调节钠离子浓

全方面阐述血清和血浆的关联2024/04/28

血清和血浆均是不含细胞（包括血小板）等有形成分的血液液体部分，其主要区别是血清不含凝血因子和血小板，血浆则含有凝血因子，它们的制备方法如下：1、血清的制备：获得的血液不能抗凝，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心（一般为3000rpm，离心5～10min），得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分），分装备用。2、血浆制备：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液=1：9，将血液加到一定量后颠倒混匀，离心（离心条件

ELISA免疫检测显色与比色详情2024/04/22

酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术ELISA检测是一种免疫检测方法，通常用于测量生物样品中的抗体或抗原，包括蛋白质或糖蛋白。像其他免疫检测法一样，它们依靠抗体与目标的结合来促进检测。一、显色ELISA试剂盒里的显色液A和B成分：如果你是HRP的二抗，显色液A、B的成分一般是H2O2和TMB（或OPD），至于具体A是那一个B是那一个你要看说明书。HRP催化过氧化物H2O2，其反应式如下：D＝TM

PCR反应各种类掌握指导2024/04/16

聚合酶链式反应PCR（polymerasechainreaction），主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA丨片段呈几何倍数扩增。PCR的分类：PCR有很多种，核心就是用引物扩增特定的DNA，以指数方式倍增的DNA达到可以观察到

双抗夹心ELISA法重点分析2024/04/16

酶联免疫吸附分析Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。常见的ELISA类型双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。1、包被抗体许多物质可作为固相载体，如聚丙酰胺和纤维素等，在进行抗体固定化之前，

ELISA试验操作过程注意点汇总2024/04/01

ELISA技术原理将抗原抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合的免疫检测技术，利用酶标技术标记抗原或抗体，通过显色反应，用以检测相应的抗体或抗原，对其进行定性或定量分析。ELISA实验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。下面一步步分析ELISA试验操作中可能影响结果因素。1、标本的选择与准备用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等

PCR引物设计详述2024/03/25

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱

抗原抗体反应反应关键方面阐述2024/03/18

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化。由于抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体检测中多以血清为试验材料，故将体外抗原抗体的免疫学反应也称作血清学反应(serologicalreaction)。该反应既可用已知的抗原检测未知的抗体，这是临床上常用的血清学诊断方法；也可用已知的抗体检测未知的抗原，如微生物及其

ELISA实验标准品使用说明2024/03/11

ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA实验成功与否的关键点。正确溶解、稀释标准品尤其重要，以下一起了解下：1.粉末标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。2.根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水，加水后轻柔涡旋震荡，室温静置溶解10-30min，让粉末*溶解。注意：加水后暂不用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解，枪头带出部分蛋白，待溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀。3.标准品梯度稀释:（1）标准品稀释液的选择：若血清、血浆、组织匀浆样本，用试剂盒中的标准品稀释液，梯度稀释标准品。若细