精品视频一区二区三区 实时荧光定量PCR技术实验准备与步骤

         实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。
一、PCR实验前的准备:
在开始PCR实验之前，必须准备好DNA模板（基因组DNA或逆转录制备的cDNA）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)

2、引物的特异性影响 PCR 成功的概率，良好的引物设计对 PCR 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。PCR引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(Tm)。Tm 定义为在此温度下，DNA 双链体的一半将解离成单链 DNA。52-58C 范围内的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和Oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
二、PCR实验步骤方法如下：
根据PCR使用说明进行试剂混合预配，并设置 PCR 循环。简而言之，PCR需要经过以下循环：

1、初始化步骤
这仅对热启动 PCR 必须的。此步骤将溶液加热至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2、变性步骤
DNA是双链分子，DNA扩增需要引物与单链DNA模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 DNA 分子。此时进入 PCR 循环。
3、退火步骤
变性后，反应混合物中的 DNA 模板是单链的。由于引物与DNA模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 DNA 组装。
4、伸长步骤
在此步骤中，DNA 聚合酶开始合成 DNA，因此温度应为 DNA 聚合酶的最适温度。一般选择 72°C，但有些酶在 68°C 时效果更好。这一步与体内DNA复制非常相似，DNA聚合酶将dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链DNA片段。延伸时间取决于目标 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的能力。一般来说，DNA 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
5、2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 PCR 过程使用 30-35 个循环。在 PCR 循环的早期，PCR 产物以指数速率积累，而在 PCR 循环的后期，随着 dNTPs、引物的减少和 DNA 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，PCR 速率逐渐下降。
6、最终伸长率。
30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链DNA。
7、贮存。
最终产品可以在 PCR 机器中维持温度在 4-10℃。