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精品视频一区二区三区 细胞冻存实验重点干货分享

来源:上海抚生实业有限公司   2024年05月27日 15:35  

        细胞冻存是指将细胞放在低温环境,以达到减少细胞代谢的作用,从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的,以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则,慢冻可使细胞逐步脱水,细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。


一、原理

当温度低至-70℃时,细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止,低于-130℃时,细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。

冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)能快速穿透细胞膜进入细胞,降低冰点,延缓冻存过程,同时增加细胞膜的通透性,提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而达到保护细胞的目的。


二、贴壁细胞冻存操作步骤

1、预热冻存液;

2、用PBS冲洗细胞,加入胰酶消化(此步骤同细胞传代操作);

3、终止消化后,重悬细胞,转移至无菌EP管,1000rpm离心5min;

4、弃上清,加入预热的细胞冻存液,细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml,一般不低于5×10^5/ml;

5、分装完毕后,拧紧冻存管盖并做好标记;

6、将分装好的冻存管转入程序降温盒,放入-80℃冰箱过夜;

7、将冻存管转移至液氮长期保存。


三、悬浮细胞冻存操作步骤

1、用移液管将细胞悬液吹吸均匀,将细胞悬液移入离心管;

2、1000rpm离心 3 min,收集细胞沉淀;

3、用预热的冻存液重悬细胞,细胞冻存最佳密度为3-5×10^6/ml,一般不低于5×10^5/ml;

4、分装完毕后,拧紧冻存管盖并做好标记;

5、将分装好的冻存管转入程序降温盒,放入-80℃冰箱过夜;

6、将冻存管转移至液氮长期保存。

QQ截图20240527153159.jpg

贴壁细胞冻存操作示意图

注意事项:

① 细胞培养、传代以及冻存需要严格的无菌操作。

② 传代时需要适度的消化,消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

③ 传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。

④ 细胞冻存液需提前配制,不可直接将DMSO加入细胞悬液中。

⑤ 应选择汇合度80%-90%左右,并且活力达90%以上处于对数生长期时的细胞进行冻存操作,确保细胞冻存时状态最佳,冻存密度可根据细胞特性进行调整。

⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液、全培养基等试剂都要复温至室温备用。

⑦ 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长,以免造成细胞损伤。

⑧ 冻存管的盖子一定要拧紧,否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

⑨ 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中,放置时间不要超过3天。

⑩ 液氮或冰箱距离细胞房较远,细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。


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