酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术,在检测时,受检标本(测定其中的抗原)与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体,通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据,为了保证实验数据的可靠性,在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制,下面就常见标本收集介绍:
1、血清
1、将全血收集到未经处理的测试管中,或者到不含抗凝剂的管中,如 BD 血清用真空采血管(目录号:367812)。
2、在室温下连续孵育 20 分钟。
3、4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。
4、立即分装上清液(血浆)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。
2、组织提取物
1、用干净的工具解剖组织,最好在冰上、尽快进行,以防止被蛋白酶降解。
2、将组织置于圆底的微量离心管中,并浸入液氮中进行“速冻"。将样品保存在 -80℃ 下以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。
3、对于约 5 mg 的组织片,可向管中添加约 300 µl *提取缓冲液(查看细胞/组织提取缓冲液配方),然后用电动匀浆器匀浆。
4、清洗刀片两次,每次清洗使用 300µl *提取缓冲液,然后在 4℃ 下维持恒定搅拌 2 小时(例如置于冷室中的回旋振荡器上)。
5、 4℃ 13,000 x rpm 离心 20 分钟。置于冰上,将上清液(这里是指可溶的蛋白质提取物)分装至新、预冷的管中并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。
3、细胞提取物
1、将组织培养板放置在冰上
2、吸出培养基并用预冷PBS 轻轻洗涤细胞一次
3、吸出 PBS ,加入100 mm 培养板加入0.5ml*提取缓冲液
4、收集细胞至在倾斜板中,然后移至经过预冷的离心管中。
5、短暂涡旋后在冰上孵育 15-30 分钟
6、在 4℃ 下13,000 x rpm 离心 10 分钟,沉淀不溶性内容物
7、将上清液(这里是指可溶性细胞提取物)分装至预冷的离心管中,并于 -80℃ 保存。尽可能减少反复冻融次数。
4、乳汁
1、收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
2、分装上清液并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少反复冻融次数。
5、尿液
1、收集样品并在 4℃ 下以 10,000 x g 离心 2 分钟。
2、等分上清液(血清)并在 -80℃ 下保存样品。尽可能减少冻融循环次数。
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