一、方案背景

葡萄酒酿造依赖微生物的精准发酵，尤其是苹果酸 - 乳酸发酵（MLF）对提升葡萄酒口感和稳定性至关重要。乳酸菌作为 MLF 的关键参与者，其生长和代谢对环境条件极为敏感，需要稳定的温度、湿度和二氧化碳浓度。二氧化碳培养箱能够精准调控这些环境参数，为葡萄酒酿造过程中的微生物培养和发酵提供理想条件，从而保障葡萄酒品质。

二、实验目的

1.利用二氧化碳培养箱优化葡萄酒乳酸菌的培养条件，提升菌种活性。

2.通过控制培养箱参数，实现高效的苹果酸 - 乳酸发酵，改善葡萄酒的风味和口感。

3.确定二氧化碳培养箱在葡萄酒酿造流程中的最佳使用方案和关键参数。

三、实验仪器与材料

（一）仪器设备

1. 二氧化碳培养箱：温度控制精度 ±0.1℃，二氧化碳浓度控制精度 ±1%，可调节湿度，配备可视化监控系统。

2. 电子天平：精度 0.0001g，用于称量培养基和试剂。

3. 无菌操作台：提供洁净的微生物操作环境，避免污染。

4. 恒温振荡器：辅助乳酸菌培养过程中的均匀混合和通气。

5. 分光光度计：测定乳酸菌菌液的吸光度，评估菌体生长情况。

6. pH 计：实时监测发酵液的酸碱度变化。

7. 灭菌锅：对实验器材和培养基进行高温高压灭菌。

（二）实验材料

1. 葡萄酒乳酸菌菌种（Oenococcus oeni）

2. MRS 培养基：添加碳酸钙以中和乳酸菌发酵产生的酸

3. 新鲜葡萄汁：经 0.22μm 滤膜过滤除菌

4. 苹果酸标准溶液

5. 氢氧化钠标准溶液（0.1mol/L）

6. 无菌培养瓶、移液枪、枪头、试管等耗材

7. 75% 乙醇、次氯酸钠溶液等消毒试剂

四、实验过程

（一）乳酸菌的活化与扩培

1. 活化：将保存的葡萄酒乳酸菌菌种接种至含有碳酸钙的 MRS 液体培养基中，置于二氧化碳培养箱内。设定温度为 25℃，二氧化碳浓度为 5%，湿度 85%，培养 48 小时，观察菌种复苏情况。

2. 扩培：取活化后的菌液，按照 1% 的接种量转接至新的 MRS 液体培养基中，同样在二氧化碳培养箱内，将温度调整为 28℃，二氧化碳浓度 6%，继续培养 24 小时，期间每隔 6 小时取样，使用分光光度计在 600nm 波长下测定菌液吸光度，监测菌体生长对数期。

（二）苹果酸 - 乳酸发酵实验

1. 准备发酵液：将除菌后的新鲜葡萄汁分装至无菌培养瓶中，每瓶 500mL。

2. 接种：将扩培后的乳酸菌菌液按照 2% 的接种量接入葡萄汁中，轻轻摇匀。

3. 设置培养条件：将接种后的培养瓶放入二氧化碳培养箱，设定温度为 20℃，二氧化碳浓度 8%，湿度 90%，进行苹果酸 - 乳酸发酵。

4. 参数监测

1. 乳酸菌活菌数：每天取样，采用稀释涂布平板法，在 MRS 固体培养基上进行菌落计数，计算每毫升发酵液中的活菌数量。

2. 苹果酸含量：使用酸碱滴定法，以酚酞为指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定发酵液中的苹果酸，根据消耗的氢氧化钠体积计算苹果酸含量。

3. pH 值：使用 pH 计实时测定发酵液的 pH 变化，记录数据。

（三）葡萄酒品质检测

1. 理化指标检测

1. 酒精度：采用蒸馏法结合密度测定，计算葡萄酒的酒精度数。

2. 总酸：以酚酞为指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定，测定葡萄酒中的总酸含量（以酒石酸计）。

3. 挥发酸：通过水蒸气蒸馏，收集馏出液后用氢氧化钠标准溶液滴定，测定挥发酸含量（以乙酸计）。

2. 感官评价：发酵结束后，邀请 5 名专业品酒师组成品鉴小组，从色泽、香气、口感三个维度对葡萄酒进行感官评分。评分标准参考国际葡萄酒品鉴体系，满分为 100 分。

五、实验结论

1. 最佳培养参数：二氧化碳培养箱用于葡萄酒乳酸菌培养和苹果酸 - 乳酸发酵时，最佳参数为温度 20℃、二氧化碳浓度 8%、湿度 90%。在此条件下，乳酸菌活菌数在发酵第 3 天达到峰值，为 8.2×10⁷ CFU/mL，显著高于其他参数组合下的菌体数量。

2. 发酵效果提升：苹果酸 - 乳酸发酵效率显著提高，发酵周期从常规条件下的 10 - 12 天缩短至 7 天，苹果酸降解率达到 92%，发酵后葡萄酒 pH 稳定在 3.2 - 3.4 之间，挥发酸含量控制在 0.5g/L 以下，符合优质葡萄酒标准。

3. 品质优化：经二氧化碳培养箱辅助发酵的葡萄酒，酒精度稳定在 12.5% vol 左右，总酸含量为 5.5g/L，酒体酸度平衡。感官评价结果显示，该葡萄酒色泽清亮，果香与发酵香气融合良好，口感圆润饱满，平均感官评分达到 88 分，较未使用二氧化碳培养箱的对照组提高 15%。

4. 应用价值：二氧化碳培养箱通过精准的环境控制，为葡萄酒酿造提供了标准化、可重复的微生物发酵解决方案，有效提升了葡萄酒的品质和生产效率，适用于葡萄酒酿造企业的规模化生产和工艺优化。

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