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化学感受态细胞的规范操作方法
2020-12-4 阅读(1423)
化学感受态细胞是常规克隆和亚克隆实验应用较为合适的解决方案。经氯化钙处理，促进质粒DNA黏附于感受态细胞膜上。将感受态细胞通过水浴热激，使细胞膜孔打开，从而质粒可以进入。
操作方法：（以下操作均按无菌条件的标准进行）
1、取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。
以下实验以100μl感受态细胞为例。
2、向感受态细胞悬液中加入目的DNA（50μl的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟。
3、将离心管置于42℃水浴中放置90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
4、向每个离心管中加入500μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5、将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。
注：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000rpm,2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）
注意事项：
1.进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。
2.感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免感受态细胞的转化效率。
3.为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到很低的程度。
