基因表达调控的方式有很多种，但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白质水平进行调控。多数的方式仅能对基因进行高效的、瞬时的调控，这在某些应用场景下非常有优势。也可以通过质粒、转座子、病毒的随机整合或同源重组完成稳定的和可遗传的DNA修饰。但是，要实现位点特异性的整合是非常耗时且困难的。随着的基因组编辑工具不断被发现，位点特异性稳定修饰变得更容易实现。

在过去的十年中，锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）技术被确立为位点特异性基因组修饰的有用工具，但随着近规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）技术的出现，它成为了另一种有效的替代方案。

通过基因组编辑靶向修饰细胞DNA为基础生物学研究、早期药物发现和新型细胞疗法（例如免疫疗法）的开发提供了强有力的工具。

CRISPR技术利用工程化核酸酶在靶基因组位置删除、插入或替换基因（Gaj et al., 2013）。Cas9核酸酶在基因组DNA中产生双链断裂，从而诱导两种可能的细胞修复过程：1.非同源末端连接（NHEJ）可导致功能基因的缺失，因为它在关闭断裂时通常伴随突变。2.如果可获得部分同源供体序列，则可通过同源依赖性修复（HDR）进行基因的插入或替换。为了在特定靶序列上进行这种修饰，核酸酶与序列特异性DNA结合，将核酸酶导向靶序列。

如上所述，对于基因组编辑，工程化核酸酶用于在靶基因组特定位置删除，插入或替换基因。这种工程化核酸酶通常由两个元件组成：内切核酸酶DNA切割模块和序列特异性DNA结合结构域。核酸酶切割双链DNA，产生双链断裂（DSB）。DSB诱导细胞DNA修复过程。这可能会发生两种类型的修复过程，1.如果没有可用的同源供体片段-无论是相应的等位基因还是外部供体DNA-断裂的末端将被重新连接。该过程称为非同源末端连接（NHEJ），并且通常可能导致基因功能元件缺失的突变。

如果存在同源的序列，例如基因组等位基因或外源供体DNA，则可以通过同源重组修复（HDR）进行基因的插入或替换。NHEJ与HDR的频率取决于实验设置，例如细胞类型和供体量。

这些核酸酶与序列特异性DNA结合结构域的组合可以定制以识别几乎任何序列，以位点特异性的方式进行基因组编辑。

常用的位点特异性的基因组编辑工具有以下三种：

·   ZFN

·   TALEN

·   CRISPR/Cas9

CRISPR技术来源于细菌防御病毒入侵的途径，目前已经广泛地应用于真核生物的基因组编辑。相较于ZFN和TALEN，它更具有灵活性。

与ZFN和TALEN相比（详见下文），基于CRISPR的基因组编辑依赖于两个独立的组件一起工作：

由于DNA特异性部分是RNA分子，因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易设计和生产。此外，通过将Cas9核酸酶与靶向不同位点的几种gRNA一起转移，可以进行多基因组编辑。

锌指（ZF）蛋白是自然界中丰富和通用的DNA结合结构域(Tupler R et al., 2001)。单个锌指结构域结合3个DNA碱基对。由于它们的模块化结构，它们为设计人工序列特异性结合分子提供了理想的框架。ZF与内切核酸酶（主要是Fok1）的融合构建了锌指核酸酶（ZFN）。两种这样的ZFN组合起作用以结合靶DNA序列的有义和反义链。结合后，Fok1核酸酶形成活性二聚体并诱导双链断裂，引起随后的细胞修复过程。

2009年，科学家们发现转录激活因子样效应子（TALEs）可作为更简单的模块化DNA识别蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是来自植物病原菌属Xanthomonas天然存在的蛋白质，并且含有DNA结合重复序列，每个重复序列识别单个碱基对。与锌指的基于三联体的DNA结合相比，TALE-DNA结合重复的这种单碱基识别模式使得设计具有更大的灵活性，但也存在一些克隆挑战。同样，工程化的TALE通常与Fok1核酸酶融合以构建TALE核酸酶融合物（TALEN）。与ZFN一样，必须为每个靶标产生一对TALEN，每个单体结合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有义或反义链。