精品网站在线免费观看 HUVEC人脐静脉内皮细胞培养方略

人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)，是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。

1：HUVEC细胞形态：

内皮细胞样，贴壁生长，鹅卵石状外观，核大而暗；

在增殖过程中，细胞小且大小均匀，有丝分裂指数高，无平滑肌细胞。

很多小伙伴认为没有包被培养瓶似乎对培养影响不大，这里建议大家，复苏和传代均需要包被，包被后的细胞长的更圆润饱满传代后的贴壁率也会有所提高。
1、在开始操作程序前，提前准备好所需要的试剂，重组人纤连蛋白、pbs磷酸缓冲液，离心管、移液枪、培养瓶等，以确保尽快完成解冻程序。

2、以 T25 培养瓶为例:吸取2.5mlPBS磷酸盐缓冲液转移到T25培养瓶中，再将100ul移液枪调到50，吸50ul重组人纤连蛋白加入到T25培养瓶中，加完之后要混匀铺满整个瓶子底部 ；包被时间:过夜(12-16h)，至少也需 37℃,2h 以上。

注意事项：细胞复苏或传代之前培养瓶需提前2小时包被。

2.HUVEC细胞解冻复苏

1、提前室温平衡人脐静脉内皮细胞专用培养基。

2、准备一个包被好的培养瓶,把剩余包被液吸尽后加入5ml的dpbs 清洗一遍倒掉,再添加 5ml 室温平衡专用培养基，同时准备一个15mL离心管,添加5ml含10%血清的其他培养基(用于离心）。

3、将冻存管快速在37℃水浴槽中解冻HUVEC细胞,至细胞全部融化(请在1-2分钟内完成)。

4、立即取出冻存管75%乙醇擦拭消毒冻存管表面，转移至生物安全柜，将细胞悬液加入到提前准备好的离心管里。

5、在室温，200g(1000rpm)离心5min。

6、弃去上清 ,用手指弹松细胞沉淀 ,添加 2ml专用培养基重新悬浮细胞后，接种至1个T25培养瓶中，培养瓶中总共完培5-7ml。“画8字法”使细胞均匀分布。

7、在 37℃、5%CO2 和 95%空气条件下进行细胞培养,透气瓶可直接放入培养箱，非透气请拧松放入培养箱。

8、在复苏后第二天16h后可观察贴壁情况,有少量漂浮可以不用换液,约3-4天可进行传代。
3.HUVEC传代：

注意：当HUVEC细胞密度达到85%-95%时，即可进行传代。

1、弃去培养液,用 PBS 洗涤 1-2次;

2、将 Trypsin-EDTA.(0.05%)(语纯生物货号:YC-5004)、 huvec细胞培养基（语纯生物货号：CC0122）、含 10%FBS 其它培养基(用于终止液)置于室温平衡。

3、弃去培养瓶中培养基,用 5ml 无钙镁离子 PBS 缓冲液(语纯生物 货号:YC-5013)清洗细胞层尽量去除液体后加入 1ml 的 0.05%胰酶消化液 37℃消化至细胞变圆,用手轻拍瓶尾成流沙样脱落;脱落率约 80%。

4、此时,立即加入3-5ml其他完培培养基(含10%血清)终止消化,轻柔吹打瓶内3-6下,将细胞悬液转移到15ml离心管,200g(1000rpm)室温离心5min;

5、弃上清，用手指弹松细胞细胞沉淀，加入新鲜专用培养基后视推荐传代比例和细胞计数后进行接种若干新的T25培养瓶中;培养基t25添加5-7ml；

6、每2天更换一次培养基。