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小动物活体成像系统是生命科学领域研究动物模型动态生理病理过程的重要工具，尤其在肿瘤研究、基因表达分析、药物研发等领域应用广泛。其使用涉及多环节精细操作与技术要点，以下从系统组成、操作流程、参数优化、数据采集与分析及注意事项等方面展开详细阐述。
一、系统组成与原理
小动物活体成像系统核心组件包括高灵敏度制冷 CCD 相机、激发光源(如氙灯或 LED 光源)、滤光片组、成像暗箱及配套软件。基于生物发光(如萤火虫荧光素酶报告基因)或荧光标记(如绿色荧光蛋白 GFP 及其衍生物)原理，通过检测动物体内外源或内源光源信号，实现对细胞活动、基因表达、肿瘤生长等过程的可视化与定量分析。
二、操作流程
(一)动物准备
1. 麻醉与固定：依据实验动物种类(小鼠、大鼠等)和体型，选择合适的麻醉方式，如异氟烷吸入麻醉腹腔注射麻醉，确保动物在成像过程中保持静止且生命体征平稳。将麻醉后的动物轻柔俯卧或仰卧位放置于恒温成像台上，维持体温(37℃左右)，减少因低温导致的代谢变化对实验结果影响。
2. 毛发处理：若成像部位被毛发覆盖，需小心剔除毛发，可使用专用脱毛剂或电动剃毛器，避免损伤皮肤。脱毛后用清水清洁皮肤，防止残留化学物质干扰成像。
(二)荧光标记与底物注射
1. 荧光蛋白表达：对于转基因荧光小鼠模型，确认荧光蛋白表达稳定且均匀。若需增强信号，可在实验前适当时间(依荧光蛋白特性而定，如 GFP 通常无需提前处理)给予动物特定刺激(如诱导基因表达的药物)或按实验设计进行操作。
2. 外源性荧光染料标记：根据研究目的，通过尾静脉、腹腔或局部注射等方式给予荧光染料标记的细胞、抗体或药物。精确控制注射剂量与时间，记录注射信息，确保实验可重复性。例如，量子点标记的肿瘤细胞注射后需等待足够时间使其靶向富集到病变部位。
3. 生物发光底物注射：若采用生物发光成像，在成像前合适时间(一般萤火虫荧光素酶底物 D-luciferin 在小鼠体内注射后 5 - 15 分钟达到发光峰值)按体重计算并注射适量底物，迅速将动物转移至成像系统，减少信号衰减。
(三)仪器参数设置
1. 光源调节：根据荧光标记的激发光谱，选择合适的激发光源波长与强度。对于多色荧光成像，需配备对应的滤光片组合，精确切换激发与发射滤光片，以区分不同荧光信号。调整光源亮度时，避免过强导致动物组织光毒性损伤或荧光淬灭。
2. 相机设置：设置相机曝光时间、增益等参数。曝光时间过长可能导致信号饱和或动物移动产生伪影，过短则信号弱、信噪比低。增益适度调整可增强弱信号，但过高会引入噪声。对于低光照生物发光成像，可适当增加曝光时间与增益，同时利用软件降噪功能。
3. 成像视野与分辨率：根据动物大小与研究部位，调整成像视野大小，确保目标区域完整包含在视野内。通过调整镜头焦距、光学放大倍数等获得合适空间分辨率，平衡视野范围与细节分辨能力，例如研究全身肿瘤转移时用较大视野，观察微小病灶局部变化则需高分辨率。
(四)成像采集
1. 预扫描与定位：在进行正式成像前，可进行低分辨率预扫描，快速确定动物大致位置与目标区域，便于精准调整动物姿态与成像参数。利用软件实时预览功能，观察动物轮廓与标记信号初步分布，必要时微调动物位置，保证成像准确性。
2. 多时间点动态成像：为监测动态过程，如肿瘤生长、药物代谢动力学，设置多个时间点进行连续成像。合理间隔时间取决于研究进程速度，如药物分布可能在给药后几分钟至几小时快速变化，而肿瘤生长监测可间隔数天至一周。每次成像保持动物姿势、成像参数一致，减少人为误差。
3. 多模态成像(如有)：部分系统具备 X 光、CT 或 MRI 等多模态成像功能，结合光学成像可获取更全面信息。先进行光学成像，随后按需进行其他模态扫描，注意不同模态间动物位置配准与参数转换，实现精准融合分析。
三、数据采集与分析
(一)数据采集
成像过程中，系统软件实时采集光学信号并转换为数字图像数据，记录每个像素的光子计数或灰度值。对于荧光成像，分别采集不同通道荧光图像；生物发光成像则获取发光强度随时间变化的动态数据。同时记录动物基本信息、实验操作步骤、成像参数等元数据，便于后续分析溯源。
(二)图像处理与定量分析
1. 背景扣除：利用软件工具扣除背景噪声，如采用滚动球算法、阈值设定等方法，去除非特异性信号干扰，突出目标区域信号。对于生物发光图像，扣除动物自体荧光背景；荧光成像则扣除未注射标记物的对照动物背景信号。
2. 信号定量：在扣除背景后的图像上，通过划定感兴趣区域(ROI)，如肿瘤病灶、特定器官等，软件自动计算区域内平均荧光强度、总光子数等定量参数。对于生物发光，还可分析发光峰值、达峰时间、半衰期等动力学指标；荧光成像可比较不同组别或时间点荧光强度变化，评估基因表达差异、药物疗效等。
3. 数据归一化：为消除个体差异、注射剂量变异等因素对结果影响，常将定量数据进行归一化处理。如以初始信号值为基准，计算相对变化值；或以某对照组平均值为参照，比较实验组相对比率，使数据更具可比性与统计学意义。
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