精品视频一区二区三区 脐带间充质干细胞原代分离有困难?不妨看看这篇文章......
自友康正式发布GMP级间充质干细胞无血清培养基后,很多老师前来咨询:
你们的原代分离工艺是否有变化啊?
我怎么养了好几天还没有看见细胞爬出啊??
我怎样操作才能分离尽可能多的原代细胞,做出你们展示的数据啊???
。。。
莫慌!小编在这里带着大家梳理一下友康体系脐带MSC的分离及传代工艺,本工艺适用于新款及老款的无血清培养基。
PART-01
试剂耗材的准备
1. 将医用剪刀、组织镊、手术柄、手术刀等器械提前灭菌。
2. 150mm培养皿或T-175培养瓶。
3. 将5mL培养基因子添加于一瓶500mL培养基中,配制为wan全培养基
PART-02
原代细胞的分离
1. 用含25mg/L庆大霉素的DPBS清洗脐带3遍,后用不含庆大霉素的DPBS清洗脐带至清洗液无血色。
2. 使用医用剪刀将脐带处理成2cm大小的组织段,每段组织沿脐带静脉将脐带剪开。
3. 使用组织镊撕去脐带静脉内膜、外皮、两根动脉使华通氏胶充分暴露。
4. 使用手术刀将华通氏胶剪切成边长 3-5mm 的小块,每2cm组织段切成的华通氏胶小块接种于一个150mm培养皿中使组织块均匀分布,添加10mL-15mLwan全培养基。
特别提示:此处组织块的大小极为关键,组织块过小不易贴壁,细胞难以爬出;组织块过大细胞爬出时间将延后,3-5mm边长是友康测试最为合适的大小。
5. 24-48h 后,补充wan全培养基至30mL。
6. 7天全量换液。
7. 10天全量换液。
8. 12-14天收获原代细胞。
使用其它表面积培养皿接种量如下:
PART-03
连续传代
1. 培养72h后,在显微镜下观察培养的MSC细胞,当细胞融合度达到 90%,即可传代。
特别提示:
细胞融合度请勿超过100%,特别是切勿使局部过密,导致叠层生长,甚至聚集成球,会导致细胞严重衰老及分化。再者传代前细胞生长过密(细胞融合度过高),导致细胞消化异常(细胞整片或成片脱落),加之随后的不当操作(用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞),此操作所导致的机械损伤会严重损害细胞膜,引发大比例的细胞死亡,特别是这些细胞经冻存后再次使用时。
2. 在超净台中,弃去培养瓶中的培养液,加入10 mL PBS清洗细胞后弃去。
3. 加入3 mL 干细胞温和消化酶常温下消化细胞。
4. 在显微镜下观察到细胞全部收缩变圆,且有少量细胞开始流动时(一般2-5分钟),立即加入温和酶使用量2倍体积(6mL)的细胞培养上清或者wan全培养基稀释细胞悬液。
特别提示:
使用培养上清液或wan全培养基稀释温和消化酶(货号:NC1004.1)对细胞有较好的保护作用,比使用DPBS等缓冲液会多
回收10~30%的细胞,而且培养上清液或wan全培养基能够更好的保持细胞活性,能一直维持较高的扩增倍数。
5. 用移液器轻轻吹打瓶壁上未wan全脱离的细胞,并轻轻吹打混匀,使细胞wan全分散。
特别提示:
进行该操作时动作一定要温和,因为细胞消化过程中的细胞损伤,更多的是来自于类似吹打与离心的机械损伤。
6. 将细胞悬液转移到15 mL 离心管中,300g离心5 min。弃上清,加入2mLwan全培养基重悬细胞,使用台盼蓝染色,或流式细胞仪等方法计数。
7. T175瓶加入35mLwan全培养基。按密度8000 cells/cm2 接种细胞。
特别提示:
应让培养基沿培养瓶的上表面(细胞生长面的相对面)或侧表面加入,切忌冲到培养瓶底面,否则容易在培养基冲刷到培养瓶底面位置出现细胞生长空白区域。
离心步骤不可去除,干细胞温和消化酶短时间内对细胞无损伤,但切勿超过10分钟。
8. 将培养瓶置于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。
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