通过NIR-II荧光成像与尿液的比色分析对肠道屏障的完整性实现无创检测与监测

本文要点：肠道屏障完整性的动态变化与多种疾病的发生及进展密切相关，对其精准检测与实时监测可为优化治疗方案提供关键信息。本研究开发了一种基于谷胱甘肽包裹金纳米簇（Au-GSH）的双功能策略，通过体内近红外二区（NIR-II）荧光成像与体外比色尿液分析相结合，实现肠道屏障完整性的无创检测与动态监测。经口服后，Au-GSH的体内分布行为可随肠道屏障完整性状态发生显著改变：当屏障受损时，其超小尺寸（低于肾小球滤过截留阈值）可选择性渗透至膀胱，并通过尿液快速排出。这一过程可通过实时无创采集Au-GSH的NIR-II荧光信号（>1100 nm）进行可视化追踪。此外，基于Au-GSH的类过氧化物酶活性建立的比色尿液分析体系进一步提升了检测灵敏度与定量能力。实验表明，该策略成功检测到溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型中典型的肠道屏障损伤特征，并实现了对治疗性及预防性干预模式下屏障修复过程的动态监测。该技术为肠道屏障相关疾病的诊断与疗效评估提供了新型研究方法。

动物活体成像系统

本文通过简单的一步反应，合成了具有近红外二区（NIR-II）荧光发射、肾脏排泄行为及类过氧化物酶活性的金-谷胱甘肽分子簇（Au-GSH）（图1a），其可通过体内NIR-II荧光成像与体外比色尿液分析同步实现肠道屏障完整性的无创检测与监测（图1b）。值得注意的是，口服Au-GSH后，仅当肠道屏障完整性受损时，Au-GSH才能高效渗透屏障进入膀胱并通过尿液排出。这一过程可通过实时无创采集Au-GSH发射的>1100 nm的近红外荧光信号进行体内NIR-II荧光成像可视化追踪。基于Au-GSH的类过氧化物酶活性，进一步建立了简易的尿液比色检测方法以评估肠道屏障完整性，从而提升了检测性能。此外，基于Au-GSH的NIR-II荧光成像与比色尿液分析策略成功实现了对受损肠道屏障完整性修复过程的监测，展现出在临床实践中评估肠道屏障完整性相关疾病预后的巨大潜力。

本文采用谷胱甘肽（GSH）作为封端剂，通过简单的一步还原法制备了Au-GSH。获得Au-GSH后，开始评估其用于基于NIR-II荧光成像和比色尿液分析的肠道屏障完整性检测与监测的关键特性。首先，分析了Au-GSH的光物理性质。其紫外-可见-近红外（UV–vis–NIR）吸收光谱（图2a）显示出一条延伸至900 nm的下降曲线，无特征峰，这与典型的金簇吸收特性一致。在808 nm波长激光激发下，发射光谱显示Au-GSH在NIR-II窗口（1000–1400 nm，图2a）内发光，峰值位于1047 nm。良好的光稳定性是体内荧光成像的前提。

图2. Au-GSH显示出NIR-II荧光发射能力、快速肾脏排泄行为和过氧化物酶样催化活性

鉴于GSH优异的抗污能力可屏蔽内源性蛋白质吸附，且透射电镜（TEM）图像（图2c）直观证实Au-GSH超小尺寸（约4.5 nm，低于肾小球滤过截留阈值~5.5 nm），对Au-GSH具备快速肾脏排泄潜力展开评估。通过静脉注射Au-GSH后，在小鼠腹侧进行NIR-II窗口（>1100 nm）实时荧光成像（图2d），结果显示：注射后荧光信号迅速定位于膀胱，10分钟开始显著积累，1小时后膀胱信号减弱并伴随尿液中NIR-II荧光出现。随时间推移，膀胱部位荧光强度逐渐降低，6小时大部分消退，24小时消失。NIR-II成像直观表明Au-GSH主要通过尿液排泄，其他组织无显著蓄积。基于此，收集注射后24小时尿液分析排泄动力学（图2e），发现约85%的Au-GSH在此时间段内排出，其中80%在6小时内已清除（图2f），证实其快速排泄特性及低体内滞留毒性。

基于Au-GSH肾脏排泄行为及先前发现的纳米金簇人工酶活性，本研究进一步探索其类过氧化物酶催化活性，以期建立图2g所示比色尿液分析方法，辅助NIR-II成像技术以提升肠道屏障完整性检测性能。实验显示，当Au-GSH与H₂O₂共存时，TMB溶液可由无色变为蓝色，并在652 nm处吸光度（A₆₅₂）达到峰值（图2h,i），表明Au-GSH催化H₂O₂产生活性羟基自由基（OH•）氧化TMB生成蓝色产物，印证其酶活性。通过优化反应时间、化合物（NaCl、H₂O₂）浓度及环境pH等条件，建立比色检测体系，其催化活性与Au-GSH浓度呈强相关性（Pearson’s r=0.9987；图2j）。随后验证该方法的可行性：注射Au-GSH后1、3、12、24小时收集尿液，基于催化活性计算排泄量并与ICP-MS（金属定量金标准）结果对比，显示二者高度相关（Pearson’s r=0.7365），证实比色法可简便、定量且低成本检测尿液中Au-GSH浓度（图2k）。综上，Au-GSH的快速肾脏清除行为可通过无创实时NIR-II成像及简易体外比色尿液分析精准表征。

图3. Au-GSH用于分析肠屏障完整性的可行性

之后进一步探索其在评估肠道屏障完整性中的可行性。首先评估了Au-GSH的细胞生物相容性：将不同浓度的Au-GSH与不同细胞共孵育12或24小时后（图3a,b），未观察到细胞毒性，表明其适用于后续体外实验。之后，评估了Au-GSH在模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）及全胃肠道消化条件（GI：SGF中2小时，随后SIF中3小时）下的稳定性。结果显示，不同条件下，Au-GSH的荧光强度仅减弱约10%（图3c,d），且尺寸无明显变化（图3e及S8），证实其优异的稳定性。

为评估Au-GSH对肠道屏障完整性的表征能力，采用Transwell系统建立模拟肠道屏障的Caco-2单层模型（图3f）。当跨上皮电阻（TEER，评估Caco-2单层完整性的常用指标）超过300 Ω·cm²时，形成完整的肠道屏障模型（IIB）。通过右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）处理IIB单层24小时诱导损伤，建立DSS损伤型肠道屏障（DIB），表现为TEER显著降低。随后，将Au-GSH分别加入IIB和DIB的顶侧（AP，细胞层上方），并于基底外侧（BL，半透膜下方）每20分钟取样（持续120分钟），通过NIR-II荧光定量检测透过单层的Au-GSH含量。结果表明：对于IIB，基底侧样品中未检测到荧光，表明Au-GSH几乎无法穿透完整屏障；而DIB的基底侧样品荧光随时间逐渐增强（图3g），显示Au-GSH可自由扩散透过受损屏障。以上结果证明，Au-GSH的渗透行为与肠道屏障完整性密切相关，为其体内评估肠道屏障状态奠定了坚实基础。

图4. 基于Au-GSH的同时NIR-II荧光成像和比色尿液分析，用于精确检测肠道屏障的完整性

利用上述已验证的Au-GSH优势，建立一种双模式检测策略，该策略同时实现了体内无创实时近红外二区（NIR-II）荧光成像以及体外简单快速的比色尿液分析，以评估疾病状态下肠道屏障完整性的变化（图1b）。考虑到溃疡性结肠炎（UC）是一种以肠道屏障完整性缺陷为特征的炎症性肠病，选择其作为代表性疾病来展示该策略。建立了如图4a所示的DSS诱导结肠炎小鼠模型以模拟UC。为了模拟不同程度的肠道屏障损伤，小鼠被均等分为三个不同组别：从第1天至第7天口服3% DSS（标记为7天组）、从第3天至第7天口服3% DSS（标记为5天组），以及全程饮用水（标记为正常组），随后在第8天口服Au-GSH进行NIR-II荧光成像。同时，收集灌胃给药后24小时内排出的尿液，按照上述方法进行比色尿液分析（图2g–k）。

观察到的显著体重下降（图4b）与疾病活动指数（DAI）的明显升高（图4c）间接证实7天组UC模型成功建立。相较于7天组，5天组中观察到的体重下降趋势与DAI升高较为轻微，表明肠道屏障完整性仅受到微小损伤。令人欣喜的是，正常组与5天组小鼠经Au-GSH给药后仅肠道内可清晰观察到NIR-II荧光信号，而7天组小鼠在口服给药后6–8小时不仅肠道内显现荧光，膀胱区域也出现显著明亮荧光（图4d）。肉眼可轻松捕捉到7天组小鼠尿液样本使比色检测溶液从无色迅速转为蓝色（图4e,f），而正常组与5天组尿液样本未引发变化，表明开发的比色尿液分析法无需仪器辅助即可简单快速区分疾病状态、亚健康状态与正常状态，从而进一步提升检测精度。

如图4g,h所示，正常组小鼠肠道呈现健康结构，表现为完整的结肠上皮、紧密排列的肠隐窝及丰富的杯状细胞。相比之下，7天组小鼠肠道黏膜严重受损，特征为肠隐窝分支、排列紊乱及杯状细胞数量减少，而5天组小鼠杯状细胞减少程度较低，黏膜层与隐窝损伤较轻，显示损伤模式较轻微。基于上述研究，通过免疫荧光染色评估各组小鼠肠道中紧密连接蛋白（作为肠黏膜上皮细胞间主要连接结构，对维持肠道屏障机械完整性与正常功能至关重要）的表达水平。如图4i–l所示，7天组紧密连接蛋白（即occludin，图4j；ZO-1，图4l）表达水平显著低于5天组与正常组，直接证实了肠道屏障完整性的破坏。综合结果表明，基于Au-GSH的比色尿液分析法能够以简便、定量且经济高效的方式精准检测肠道屏障完整性的动态变化。

图5. 通过NIR-II荧光成像和比色尿检精确监测肠屏障恢复的进展

为进一步探索该策略在肠道屏障完整性修复监测中的潜力，首先建立溃疡性结肠炎（UC）治疗模型：小鼠连续7天口服3% DSS后，分别接受5-氨基水杨酸（一线治疗药物ASA）治疗3天或7天（标记为3天-ASA组与7天-ASA组），并通过NIR-II荧光成像与比色尿液分析全程监测修复进程（图5a）。未接受ASA或DSS处理的小鼠分别作为模型组与正常组。结果显示，所有3% DSS处理小鼠均出现体重下降（图5b）、DAI升高（图5c）、便血腹泻等症状，证实UC模型成功构建。ASA治疗后，与模型组相比，治疗组体重回升与DAI下降显著改善（图5b,c），其中7天-ASA组恢复效果更显著（p < 0.001），表明肠道屏障修复程度随时间延长而增强。NIR-II荧光成像与尿液比色分析显示，ASA治疗后肠道至膀胱的Au-GSH分布量减少，直观反映屏障完整性逐渐恢复（图5d）。该方法成功区分不同疗程（0、3、7天）的修复效果：随着治疗时间延长，尿液比色读数逐步降低并趋近正常组水平（图5e,f）。推测短期治疗（3天）仅部分修复屏障缺陷，导致部分Au-GSH仍可穿透进入循环系统；而7天治疗则有效阻断Au-GSH入血，提示屏障功能接近恢复。利用H&E染色（图5g）与AB-PAS染色（图5h）结果与NIR-II荧光成像和比色尿液分析对比（图5d–f）高度吻合，证实该策略可用于实时监测肠道屏障完整性的动态修复进程。

图6. 分析UC预防模式下肠道屏障完整性的变化

如图6a所示，实验将小鼠随机分为两组：模型组与AFP组（图6b,c）。Au-GSH给药后，NIR-II荧光成像显示小鼠胃肠道出现显著信号。值得注意的是，给药4小时后，模型组小鼠膀胱与肠道均检测到荧光信号，而正常组与AFP组荧光信号仅局限于肠道区域（图6d），表明AFP有效抑制DSS引发的肠道屏障破坏。比色尿液分析进一步验证上述结论：模型组尿液加入显色剂后快速变为蓝色（源于Au-GSH存在），而AFP组与正常组尿液未发生明显颜色变化（图6e,f）。该结果与荧光成像数据一致，证明AFP通过维持肠道屏障完整性发挥UC预防作用。H&E染色（图6g）与AB-PAS染色（图6h）结果表明，模型组结肠黏膜损伤严重且杯状细胞数量显著减少；而AFP组黏膜与隐窝结构损伤明显减轻，杯状细胞数量恢复至接近正常水平，有效维持了肠道屏障完整性。该结论与NIR-II荧光成像及比色尿液分析结果一致，进一步验证了AFP的UC预防作用。

本研究提出了一种基于Au-GSH的整合式诊断策略，通过活体实时近红外二区（NIR-II）荧光成像与外周快速比色尿液分析的无创联用，实现了肠道屏障完整性的精准检测与动态监测。Au-GSH在胃肠道及复杂生理环境中均展现出优异稳定性，其可在>1100 nm的NIR-II窗口发射强荧光信号，并具有类过氧化物酶活性。当肠道屏障完整时，Au-GSH被限制于肠腔内；而当屏障受损时，其凭借小于肾排泄阈值（~4.5 nm）的粒径可穿透肠壁进入血液循环并经肾脏快速排出。基于Au-GSH的酶活性特性，本研究开发了直接通过尿液显色反应评估肠道屏障状态的比色检测方法。该方法通过肉眼可辨的颜色信号拓宽了应用场景，同时提升了检测精度。Au-GSH优异的生物相容性进一步验证了其临床转化潜力。该策略成功应用于UC小鼠模型中不同损伤程度的肠道屏障状态区分与表征，为肠道屏障完整性相关疾病的诊断提供了新型整合式平台。

参考文献

Zhang L, Feng L, Yang L, et al. Noninvasive Detection and Monitoring of the Integrity of the Intestinal Barrier through NIR-II Fluorescence Imaging and Colorimetric Urinalysis[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2025, 17(9): 13445-13460.

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