​血管内皮-间充质串扰通过 Notch 信号驱动人成骨细胞的成骨分化

Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling

Keywords: Co-culture; Endothelial cells; Notch signaling; Osteoblasts; Osteogenic differentiation.

骨形成与血管生成密切相关。内皮细胞（EC）和骨形成细胞，如成骨细胞（OB）之间的相互作用对正常骨发育和修复至关重要。通常认为，EC 与骨组织细胞之间相互作用的主要机制与旁分泌信号有关。在骨组织中，ЕС 促进特定信号通路的激活，通过旁分泌机制刺激成骨细胞分化。相反，内皮通常会阻止血管系统中的钙化，与 EC 功能相关的疾病会导致微环境的异常变化、内皮一氧化氮（NO）分泌减少和成骨因子分泌增加，从而导致异常成骨分化和异位钙化。

然而，似乎不仅旁分泌因子对钙化过程有显著影响，考虑旁分泌信号在 EC 与可发生成骨分化的细胞之间相互作用中的影响也很重要。邻分泌（Juxtacrine）信号传导揭示了可通过位于细胞表面的各种蛋白质分子进行细胞间相互作用。在血管成骨的背景下，它可以通过以下方式实现：通过细胞粘附分子—整合素和钙粘蛋白与细胞外基质蛋白（ECM）结合；通过间隙连接—连接蛋白和配体-受体相互作用，即通过 Notch 信号通路。

揭示内皮细胞和成骨细胞相互作用的复杂机制对于理解骨内稳态和心血管组织异常矿化过程之间的平衡至关重要。最近，俄罗斯圣彼得堡 RAS 细胞学研究所及Vreden国家创伤学和骨科医学研究中心团队探索了体外成骨细胞分化的背景下介导 EC 和 OB 之间串扰的旁分泌和邻分泌机制，研究证明，在成骨分化诱导过程中，人成骨细胞和内皮细胞之间是否存在直接接触可能影响骨诱导或骨抑制作用。这一新发现奠定了 Notch 信号以及成骨细胞和内皮细胞之间的物理相互作用在成骨分化中的关键作用，并为基于 Notch 信号的成骨分化相关病理的治疗提供了潜在基础。研究成果发表于Cell Communication and Signaling期刊题为“Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling”。

首先，为了研究 EC 和 OB 之间的细胞间相互作用对成骨分化的影响，使用直接和间接共培养模型（图1 A）。结果表明，与 OB 单一培养相比，间接共培养抑制了成骨分化，而直接接触增加了基质钙化（图1 B-C）。使用 RT-PCR  在早期阶段观察到，不同的共培养条件下 OB 中相似的成骨标志物表达，除了 COL1A1 在 OB 直接共培养时有差异（图1 D）。因此，实验发现，根据细胞之间是否存在直接接触，EC 可以对 OB 成骨分化同时具有骨诱导和骨抑制作用。

图1     EC 和 OB 的共培养条件会影响成骨分化。

进一步分析 OB 和 EC 在不同共培养条件下的蛋白质组学和转录组学谱（图2 A）。在 OB 的生物信息学分析过程中，鉴定了 22351 个转录本和 2966 个蛋白质；EC鉴定了 22539 个转录本和 3073 个蛋白质（图2 B、C）。主成分分析（PCA）表明，根据转录组学和蛋白质组学数据，OB 在直接、间接和对照条件下形成混合簇（图2 D）。这表明，当 OB 和 EC 共培养时，OB 谱保持相当稳定。与成骨细胞不同，EC 在与 OB 共培养的不同条件下表现出不同的蛋白质组学和转录组学特征（图2 E），表明 EC 对与 OB 共培养的各种条件有显著的反应。

差异表达分析显示，当 OB 直接共培养时，成骨标志物和 Notch 信号通路成分的表达增加。基因本体论（GO）分析突出了与细胞外基质重组和细胞运动相关的激活过程，而激酶活性、MAPK 信号和细胞增殖等过程受到抑制。通路分析确定了细胞因子-细胞因子受体和 Notch 信号通路的激活，以及 Rap1 和 Wnt 信号的抑制。当 OB 间接共培养时，发现与细胞周期、p53 和 FoxO 通路相关的转录本下调。

当 EC 间接共培养时，在上调元件中，BMP 信号转导抑制剂、SMAD 蛋白、TGF-β 配体和 IHNBA 最为突出。Jak/STAT 通路成分在蛋白质组学和转录组学数据中也显著上调。此外，对内皮功能很重要的关键因子，包括一氧化氮合酶1（NOS1）、NOS3 和 KLF4 表达均有所增加。进一步分析确定了 TGF-β 和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的参与，而下调的转录本与细胞粘附和 Ras/PI3K-Akt 信号有关，这在蛋白质组学数据中也观察到。

当 EC直接共培养时，同样观察到参与 BMP 信号和 Jak/STAT 信号的的成分表达增加。与 EC 间接共培养不同的是，在 EC 直接共培养中观察到 PI3K-Akt 信号通路转录本的上调。然而，直接共培养过程中较显著的转录组变化与骨骼发育过程有关，涉及 RUNX2、ALPL、LOX、WNT5A、WNT5B 和骨组织胶原蛋白等关键枢纽基因。在这些信号通路中，Notch 通路成为主要参与者。已知该通路可促进内皮-间充质转化，与在直接共培养中观察到的 SNAI2、TWIST1 和 ACTA2 激活一致。实验已经确定，只有直接共培养会导致 Notch 信号成分的表达水平增加，当使用间接培养方法培养 OB 和 EC 时，在 Notch 受体和配体的表达中没有观察到这种增加。

这些数据表明，OB 在与 EC 的不同共培养条件下表现出相似的蛋白质组学和转录组学特征，而 EC 表现出不同的分子特征，表明它们对不同的共培养条件有显著的反应。与 OB 的间接共培养刺激了 EC 中 BMP 信号通路的多种抑制剂的产生，这是已知成骨分化的关键驱动因素。同时，EC 和 OB 之间的直接细胞间接触可激活 Notch 信号通路。这种 Notch 介导的信号转导反过来又诱导了 EC 群体中与成骨分化相关的基因的表达。

图2    OB 和 EC 在不同共培养条件下的蛋白质转录组学分析。

接下来，为了找出 EC 中 Notch 信号通路各种成分活性的降低如何影响直接共培养中 OB 的成骨分化，在共培养前用一种携带靶向 Notch 通路基因的 shRNA 慢病毒转导 EC（图3 A、B）。根据染色结果，发现 EC 中 Notch 信号通路的某些组分（NOTCH1、NOTCH3、NOTCH4 和 MAML1）的敲低在共培养时对 OB 的成骨转化具有抑制作用。此外，NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低显示出较强的影响。下一步继续研究了 EC 中 Notch1 或 Notch3 的胞内结构域对 Notch 的激活如何影响直接共培养过程中 OB 的成骨分化（图3 C）。OB 与过表达 Notch1（NICD1）和 Notch3（NICD3）细胞内结构域的 EC 共培养导致钙化水平增加。茜素红染色强度的定量分析证实，相对于对照共培养，OB 的成骨分化程度在统计学上显著增加或减少（图3 D）。这说明，OB 的成骨分化可以在细胞间直接接触期间通过调节 EC 中的 Notch 信号来控制。

图3    诱导成骨分化 14 天后，完整原代 OB 和转导的 EC 直接共培养的茜素红染色。

最后，为了阐明由 Notch 信号通路的失活/激活导致的 EC 的哪些变化会影响 OB 的成骨分化，实验鉴定了用慢病毒构建体（激活 NICD1 和 NICD3 或抑制 NOTCH1 和 NOTCH3）修饰的 EC 的转录组谱（图4 A）。差异表达基因（DEG）分析表明，与失活的 Notch 样本相比，Notch 结构域激活的样本中检测到的 DEG 分别高出 1.5-1.7 倍。这一趋势表明，Notch 胞内结构域的激活比敲低 Notch 受体对整体基因表达谱变化的贡献更大。由 shNOTCH1 或 shNOTCH3 转导的 EC 形成混合簇，而过表达 NICD1 和 NICD3 的 EC 在 PCA 上也彼此靠近聚集，但没有重叠（图4 B）。

在每组中显示特定改变的前几个差异表达基因（图4 C）。过表达 NICD1 和 NICD3 的 EC 显示 ANGPTL2、PLVAP、LAMB3、SLCA4、MEST、SEMA5A、GUCY1A1、SLC46A3、SFRP1、SULF1、OFLML2A、ITGA11、LINC01614、COL8A 和 SDC2 的表达增加。对于敲低 NOTCH1 和 NOTCH3 的 EC，DYSF、MMP10、PTGS1、SGK1、APLN、ANXA3、PLAT、MT2A、EDN1 和 CD247 基因的表达增加。还发现 EC 中 NICD1 和 NICD3 的过表达以及 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低均显著降低 ENSG00000284946、SPAG5、HMGB2、PLK1 和 PRC1 的表达。

此外，实验选择了一组在两个方向上都显示出对 Notch 信号调节的反应性转录谱的基因，确定在 NICD1 和 NICD3 激活的 EC 中，转录本 GJA5、SULF1、SDC1、DLL4、TMTC1、CRYAB、PTHLH 和 PCDH7 上调。相反，在 NOTCH1 和 NOTCH3 敲低的 EC 中，这些相同转录本的表达降低（图4 D）。

对 DEGs 进行功能注释，结果表明，NICD1 和 NICD3 过表达导致 EC 中表达水平升高的 DEGs 与细胞外结构、细胞外基质组织以及骨化相关的基因表达有关。同时，通过分析鉴定的代谢通路与 TGF-β 信号和 PI3K-AKT 信号通路有关。对于 EC 中 NOTCH1 和 NOTCH3 的敲低，观察到与染色体分离、DNA 复制和细胞周期相关的过程下调。

图4    Notch 激活/失活期间 EC 的转录组学特征。

图5    图形概要

总之，该研究发现内皮细胞对成骨分化过程具有双重影响。抑制成骨特性与内皮细胞分泌的旁分泌因子的作用有关。而内皮细胞的诱导成骨特性是由 Notch 信号通路介导的，并且只有在与间充质细胞（这里指成骨细胞）物理接触的情况下才能实现。研究确定了内皮细胞中 Notch1 和 Notch3 的失活抑制了成骨细胞的成骨分化，而激活内皮细胞中 Notch1 和 Notch3 提高了内皮-成骨细胞共培养物的成骨分化程度。因此，内皮细胞 Notch 通路的修饰可能是增强/抑制成骨细胞成骨分化的工具。

参考文献：Perepletchikova D, Kuchur P, Basovich L, Khvorova I, Lobov A, Azarkina K, Aksenov N, Bozhkova S, Karelkin V, Malashicheva A. Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling. Cell Commun Signal. 2025 Feb 19;23(1):100. doi: 10.1186/s12964-025-02096-0. Erratum in: Cell Commun Signal. 2025 Mar 12;23(1):133. doi: 10.1186/s12964-025-02118-x. PMID: 39972367; PMCID: PMC11841332.

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