研究背景

基于研究发现的肝脏 - 脑 - 肠神经反射弧对维持肠道免疫稳态起着关键作用，特别是其对肠道调节性 T 细胞（pTreg 细胞）生成和维持的影响，本研究方案旨在进一步深入探究该轴在肠道免疫调控中的具体机制。通过构建类器官模型并结合 Kirkstall Quasi Vivo 类器官串联芯片动态灌流系统，模拟体内复杂的生理环境，以更精准地揭示肝 - 脑 - 肠轴相互作用及其在肠道免疫中的功能。

研究目的

构建肝脏、脑干和肠道类器官，并成功将其整合至 Kirkstall Quasi Vivo 类器官串联芯片动态灌流系统中，模拟体内肝 - 脑 - 肠轴的生理结构和功能联系。

研究肝脏 - 脑 - 肠神经反射弧对肠道 APCs（抗原呈递细胞）及 pTreg 细胞分化、增殖及功能的影响机制。 探索该轴在肠道炎症发生发展过程中的作用，为开发针对肠道免疫相关疾病的新型治疗策略提供理论依据和实验支持。

一、 类器官构建与芯片整合

1. 类器官模块选择

1.1 肝脏模块：

- 来源：人iPSC分化的肝类器官（含Kupffer细胞）

- 功能：感知肠道来源代谢物（如SCFAs、LPS），激活迷走神经传入

1.2 肠道模块：

- 来源：结肠类器官（含CX3CR1⁺巨噬细胞/CD103⁺ DCs）

- 功能：维持pTreg细胞生态位，表达ALDH/视黄酸

1.3 神经模块：

- 来源：人iPSC分化的迷走神经节类器官 + 肠神经元

- 功能：传递肝-脑干（NTS）-迷走传出-肠神经信号

2. 多器官芯片连接设计

Kirkstall Quasi Vivo 类器官串联芯片动态灌流系统搭建：将构建好的肝脏、脑干和肠道类器官分别植入 Kirkstall Quasi Vivo 系统的相应芯片中，通过精确的管道连接和灌流设置，模拟体内血液循环和组织间液流动，使三个类器官在动态的微环境中相互连接和作用。优化灌流参数，如流速、流量等，确保类器官之间的物质交换和信号传递接近体内真实生理状态。

二、 关键实验干预

1. 神经通路模拟

- 激活组：在肝脏模块添加肠道代谢物（丁酸盐/LPS），诱导迷走神经激活

- 抑制组：

- 肝迷走神经切断（HVx模拟）：物理阻断肝-神经模块连接

- 药理学阻断：添加毒蕈碱受体拮抗剂（如阿托品）

2. 免疫应答检测

- 肠道模块输出：

- pTreg细胞比例（流式检测：CD4⁺FoxP3⁺RORγt⁺）

- APC的ALDH活性（Aldefluor染色）

- 视黄酸合成量（HPLC-MS检测）

三、 动态灌流参数

四、实验检测指标

4.1 细胞水平检测

• 采用流式细胞术分析肠道类器官中 pTreg 细胞的比例、数量及其表面标志物的表达情况；同时检测肠道 APCs（包括树突状细胞、巨噬细胞等）的亚群组成、活化状态以及醛脱氢酶（ALDH）表达水平和视黄酸合成能力等指标，评估肝 - 脑 - 肠轴对肠道免疫细胞的调控作用。

• 利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察类器官间神经元与免疫细胞的相互作用情况，如神经纤维与肠道 APCs 的接触部位、信号传递相关蛋白的表达等，从细胞层面揭示肝 - 脑 - 肠轴的免疫调节机制。

4.2 分子水平检测

• 通过实时荧光定量 PCR（qPCR）检测相关基因的表达变化，包括神经系统相关基因（如神经递质受体、离子通道等）、免疫相关细胞因子（如 TGF-β、IL-10、IL-17 等）以及 pTreg 细胞分化和功能相关基因（如 Foxp3、RORγt 等）。分析肝 - 脑 - 肠轴在不同实验条件下对这些基因表达的调控作用，探讨其潜在的分子机制。

• 运用 Western blot 技术检测类器官中关键蛋白的表达水平和修饰状态，如神经递质受体蛋白、信号通路相关蛋白（如 pERK1/2 等）以及免疫相关蛋白（如免疫球蛋白、细胞粘附分子等）。通过蛋白表达的定量分析，进一步明确肝 - 脑 - 肠轴在细胞信号转导和免疫调控中的作用途径。

4.3 功能水平检测

• 评估肠道类器官的屏障功能，如通过检测肠道上皮细胞层的通透性（使用荧光标记的大分子物质进行透性实验）、紧密连接蛋白的表达等指标，了解肝 - 脑 - 肠轴对肠道屏障完整性的影响，以及在肠道炎症发生过程中该轴如何调节肠道屏障功能以维持肠道内环境稳态。

• 进行体外免疫细胞功能实验，如将肠道 APCs 与 T 细胞共培养，检测 T 细胞的增殖、分化和细胞因子分泌情况，分析肝 - 脑 - 肠轴对 APCs 免疫功能的调节作用以及其对 T 细胞免疫应答的影响；同时开展 pTreg 细胞抑制功能实验，评价肝 - 脑 - 肠轴调节的 pTreg 细胞在抑制肠道炎症反应中的作用效果。

五、数据分析与统计方法

使用专业的数据分析软件对实验获得的数据进行统计学分析。对于多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若组间方差不齐则采用非参数检验方法；两组间均数比较则使用独立样本 t 检验；相关性分析采用 Pearson 相关性检验或 Spearman 秩相关检验。以 P < 0.05 为差异有统计学意义的标准，所有数据以均数 ± 标准误（Mean ± SEM）表示。通过对实验数据的系统分析，深入挖掘肝 - 脑 - 肠轴在肠道免疫调控中的作用机制和潜在规律。

六、预期结果

6.1 成功构建并整合肝脏、脑干和肠道类器官至 Kirkstall Quasi Vivo 类器官串联芯片动态灌流系统，该系统能够模拟体内肝 - 脑 - 肠轴的生理结构和功能联系，为研究三者之间的相互作用提供一个稳定、可靠的体外模型。

6.2 在正常生理状态下，肝 - 脑 - 肠轴通过神经信号传导维持肠道 APCs 的正常功能和 pTreg 细胞的稳态水平；当神经通路被阻断时，肠道 APCs 的 ALDH 表达和视黄酸合成能力下降，pTreg 细胞数量减少，肠道免疫稳态遭到破坏，表现出类似炎症性肠病的免疫失衡特征。

6.3 在肠道炎症模型中，肝 - 脑 - 肠轴的神经反射活动增强，试图通过调节肠道 APCs 和 pTreg 细胞来缓解肠道炎症反应。而通过药物干预调节该轴的功能（如激活或抑制特定神经递质受体），可以有效改善肠道炎症症状，增加 pTreg 细胞数量，增强其免疫抑制功能，从而为治疗肠道炎症性疾病提供新的潜在治疗靶点和策略。

6.4 本研究将深化对肝 - 脑 - 肠轴在肠道免疫调控中作用机制的认识，为开发基于神经 - 免疫调节的新型治疗策略提供关键实验依据和理论支持。通过Kirkstall Quasi Vivo类器官串联芯片动态灌流系统模拟体内复杂的生理环境，不仅有助于更精确地研究细胞间的相互作用和信号传递，还为未来的个性化医疗和药物研发提供了创新的研究平台和工具。

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