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HPLC 提升分离度,Poroshell 120 4μm 有的放失

来源:安捷伦科技(中国)有限公司   2025年05月27日 14:22  

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目前,在常规色谱方法中,使用长度为 250mm 或 150mm、粒径为 5μm 的色谱柱时,通常会遇到分离度稍有欠缺不能满足系统适应性要求的问题。那么,在不改变原有色谱方法、保持色谱固定相相同或相近选择性的情况下,能否还有方法改善分离度?

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提高柱效是改善分离度的关键

分离度(Rs)的好坏,与色谱柱柱效(N)、选择性(α)、保留因子(k)有关, 见分离度公式。在保持相同的选择性 α(流动相条件、柱温、固定相等)和相同色谱柱尺寸的条件下,提高柱效是改善分离度的关键。

分离度(Rs)公式:

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提高柱效的方法:


降低色谱填料颗粒的粒径

提高化合物在填料颗粒微孔中的传质效率

使用颗粒粒度更加均匀的填料

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如何提高柱效?是否会超出药典规定范围要求?

现行美国药典 USP 通则<621>中对色谱柱尺寸变化的要求是:填充剂粒径(dp)和柱长(L)的比例关系 L/dp 值或( N 值)应在原有数值的 -25%~+50% 范围内。药典色谱柱尺寸调整后方法参数允许调整的范围也是 L/dp 值或( N 值)在 -25%~+50% 范围内。

分析实践工作中,可以保持柱长(L)不变,通过降低粒径(dp)的办法,提升柱效,达到分离度改善的结果。以通用的 4.6*250mm 色谱柱为例,不同粒径色谱的 L/dp 计算结果见表 1 。

表 1. 不同粒径色谱柱 L/dp 值及压力倍数计算结果
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*备注:压力倍数是以 5μm 粒径色谱柱为基准,根据压力与粒径的平方成反比的关系计算。

从表 1 结果可见,柱长和内径保持不变,使用 4μm 和 3.5μm 色谱柱时,都可以满足 L/dp 值的变化在 -25% 到 +50% 范围内。不过,当选择更小粒径色谱柱时,需要考虑压力的问题。

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从 5μm 到 4μm,柱效提高到 2 倍

通常表面多孔型填料能满足上述对柱效提高的需求,更多内容参考 Agilent 相关资料。Poroshell 4μm 粒径色谱柱的柱效(N)相当于相同尺寸全多孔 5μm 粒径的两倍,可以利用这一点来改善常规色谱方法的分离度。从分离度公式计算,在其它条件不变的情况下,两倍柱效的提升可以提高到 1.4 倍的分离度(理论值)。这对现有方法分离度不佳或者限制于压力问题不能使用更小粒径(如3μm)色谱柱的应用来说,1.4 倍分离度的贡献是非常有用的。

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图 1. Agilent InfinityLab Poroshell 120 色谱柱

例如,某标准方法中,使用 Zobax SB-C18 4.6*250mm 5μm 色谱柱,关键组分的分离度只有 1.2。从分离度改善的角度,选择了高效传质、填料颗粒大小均匀的 4μm Poroshell 120 SB-C18 色谱柱,所有色谱方法均不改变,其分离度达到了 1.5 以上。

目前,粒径为 4μm 的 Poroshell 色谱柱包括:

封端的 EC-C18、C8

能耐低 pH、不封端的 SB-C18 柱

能耐高 pH 体系的 HPH-C18 和 C8 柱

特殊选择性的苯基己基(Phenyl-Hexyl)、五氟苯基(PFP)、SB-Aq 以及用于强极性化合物分析的 HILIC 固定相( HILIC 和 HILIC-Z)

尤其是常用的 C18 柱,当原方法使用 Zorbax SB-C18 或 Plus/XDB-C18 时,可以非常方便地转换到对应的 Poroshell 色谱柱上,而不需要对方法进行调整。

实际应用案例分享

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应用案例 1:


机动车检验标志电子化

方法要求分离度 Rs>11.5。当使用相同尺寸的 Poroshell 4μm 色谱柱时,柱效有将近一倍的提升,分离度提升 1.23 倍。在进行溶出分析或者其它快速中控分析时,选择这样的色谱柱可以适当减少柱长,达到快速分析的目的。如案例中使用 100mm 长的色谱柱,分离度和柱效依然满足药典要求。

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图 2. 萘普生片含量测定-USP 方法结果

应用案例 2:


苯扎贝特有关物质分析

方法中换成相同尺寸 Poroshell 4μm 色谱柱后,不仅分离度提升,而且柱效和灵敏度都有提升。

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图 3. 苯扎贝特有关物质的检测结果

应用案例 3:


三七皂苷的分析

所用分析方法不变,仅将所用色谱柱改为4μm Poroshell色谱柱,Rg1和Re的分离度从1.51提高到了2.31。柱效更高、压力适中的色谱柱,用于建立耐用的中药成分含量测定方法非常实用。

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图 4. 三七皂苷的含量测定结果:Poroshell 120 4µm vs. 全多孔 5µm

应用案例 4:


穿黄制剂定性指纹图谱及多组分含量测定方法研究

该研究对流动相、柱温、色谱柱等进行了选择和优化,最后确定使用 Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 250 mm, 4 µm 色谱柱,无论指纹图谱还是多组分含量测定都非常完美。

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图 5. 17 批穿黄制剂指纹图谱叠加图:1-新绿原酸;2-绿原酸;3-隐绿原酸;4-异绿原酸B;5-异绿原酸A;7-异绿原酸C;8-穿心莲内酯;9-新穿心莲内酯;10-去氧穿心莲内酯;11-脱水穿心莲内酯

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图 6. 穿黄制剂 HPLC 指纹图谱共有模式

4μm Poroshell 120 的优势和应用:





替代5µm全多孔色谱柱时,满足药典 L/dp 变化要求


与5µm全多孔填料相比,约有 1 倍柱效提升


提供多种固定相类型


200-400bar 的 HPLC 仪器都能用


含量测定、溶出、快速分析


化药有关物质检查、中药特征图谱研究

 

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Poroshell 120 4μm 系列色谱柱

 

ValueLab 液相柱

单根 59 折,3根组合 53 

 

 

 

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