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目前，在常规色谱方法中，使用长度为 250mm 或 150mm、粒径为 5μm 的色谱柱时，通常会遇到分离度稍有欠缺不能满足系统适应性要求的问题。那么，在不改变原有色谱方法、保持色谱固定相相同或相近选择性的情况下，能否还有方法改善分离度？
分离度（Rs）的好坏，与色谱柱柱效(N)、选择性（α）、保留因子（k）有关, 见分离度公式。在保持相同的选择性 α（流动相条件、柱温、固定相等）和相同色谱柱尺寸的条件下，提高柱效是改善分离度的关键。
分离度（Rs）公式：
提高柱效的方法：
▶降低色谱填料颗粒的粒径
▶
提高化合物在填料颗粒微孔中的传质效率
▶
使用颗粒粒度更加均匀的填料
现行美国药典 USP 通则<621>中对色谱柱尺寸变化的要求是：填充剂粒径（dp）和柱长（L）的比例关系 L/dp 值或( N 值)应在原有数值的 -25%~+50% 范围内。药典色谱柱尺寸调整后方法参数允许调整的范围也是 L/dp 值或( N 值)在 -25%~+50% 范围内。
分析实践工作中，可以保持柱长(L)不变，通过降低粒径(dp)的办法，提升柱效，达到分离度改善的结果。以通用的 4.6*250mm 色谱柱为例，不同粒径色谱的 L/dp 计算结果见表 1 。
*备注：压力倍数是以 5μm 粒径色谱柱为基准，根据压力与粒径的平方成反比的关系计算。
从表 1 结果可见，柱长和内径保持不变，使用 4μm 和 3.5μm 色谱柱时，都可以满足 L/dp 值的变化在 -25% 到 +50% 范围内。不过，当选择更小粒径色谱柱时，需要考虑压力的问题。
通常表面多孔型填料能满足上述对柱效提高的需求，更多内容参考 Agilent 相关资料。Poroshell 4μm 粒径色谱柱的柱效(N)相当于相同尺寸全多孔 5μm 粒径的两倍，可以利用这一点来改善常规色谱方法的分离度。从分离度公式计算，在其它条件不变的情况下，两倍柱效的提升可以提高到 1.4 倍的分离度（理论值）。这对现有方法分离度不佳或者限制于压力问题不能使用更小粒径（如3μm）色谱柱的应用来说，1.4 倍分离度的贡献是非常有用的。
例如，某标准方法中，使用 Zobax SB-C18 4.6*250mm 5μm 色谱柱，关键组分的分离度只有 1.2。从分离度改善的角度，选择了高效传质、填料颗粒大小均匀的 4μm Poroshell 120 SB-C18 色谱柱，所有色谱方法均不改变，其分离度达到了 1.5 以上。
目前，粒径为 4μm 的 Poroshell 色谱柱包括：
▶封端的 EC-C18、C8
▶
能耐低 pH、不封端的 SB-C18 柱
▶
能耐高 pH 体系的 HPH-C18 和 C8 柱
▶
特殊选择性的苯基己基（Phenyl-Hexyl）、五氟苯基（PFP）、SB-Aq 以及用于强极性化合物分析的 HILIC 固定相（ HILIC 和 HILIC-Z）
尤其是常用的 C18 柱，当原方法使用 Zorbax SB-C18 或 Plus/XDB-C18 时，可以非常方便地转换到对应的 Poroshell 色谱柱上，而不需要对方法进行调整。
应用案例 1:
机动车检验标志电子化
方法要求分离度 Rs>11.5。当使用相同尺寸的 Poroshell 4μm 色谱柱时，柱效有将近一倍的提升，分离度提升 1.23 倍。在进行溶出分析或者其它快速中控分析时，选择这样的色谱柱可以适当减少柱长，达到快速分析的目的。如案例中使用 100mm 长的色谱柱，分离度和柱效依然满足药典要求。
图 2. 萘普生片含量测定-USP 方法结果
应用案例 2:
苯扎贝特有关物质分析
方法中换成相同尺寸 Poroshell 4μm 色谱柱后，不仅分离度提升，而且柱效和灵敏度都有提升。
图 3. 苯扎贝特有关物质的检测结果
应用案例 3:
三七皂苷的分析
所用分析方法不变，仅将所用色谱柱改为4μm Poroshell色谱柱，Rg1和Re的分离度从1.51提高到了2.31。柱效更高、压力适中的色谱柱，用于建立耐用的中药成分含量测定方法非常实用。
图 4. 三七皂苷的含量测定结果：Poroshell 120 4µm vs. 全多孔 5µm
应用案例 4:
穿黄制剂定性指纹图谱及多组分含量测定方法研究
该研究对流动相、柱温、色谱柱等进行了选择和优化，最后确定使用 Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 250 mm, 4 µm 色谱柱，无论指纹图谱还是多组分含量测定都非常完美。
图 5. 17 批穿黄制剂指纹图谱叠加图：１－新绿原酸；２－绿原酸；３－隐绿原酸；４－异绿原酸Ｂ；５－异绿原酸Ａ；７－异绿原酸Ｃ；８－穿心莲内酯；９－新穿心莲内酯；１０－去氧穿心莲内酯；１１－脱水穿心莲内酯
图 6. 穿黄制剂 HPLC 指纹图谱共有模式
4μm Poroshell 120 的优势和应用：
替代5µm全多孔色谱柱时，满足药典 L/dp 变化要求
与5µm全多孔填料相比，约有 1 倍柱效提升
提供多种固定相类型
200-400bar 的 HPLC 仪器都能用
含量测定、溶出、快速分析
化药有关物质检查、中药特征图谱研究
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