1、 生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)
2、 在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)
3、 切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体, 10-20片叶子需要5-10mL酶解液)
4、 迅速将切下的样品转到酶解液中,要求全部浸没。
5、 黑暗条件下抽真空30min。
6、 连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h
7、 利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大小)
8、 在过滤前加入等量的W5溶液
9、 洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤
10、 离心100g,1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2 次
11、 重悬原生质体于W5中,保持在2*105个 /ml,冰浴30min。
12、 100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约 2*105个/ml
13、 加入10μL质粒(1000ng-2000ng )于2ml离心管中
14、 加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。
15、 加110μL PEG solution,轻弹使充分混匀
16、 23℃室温孵育30min。
17、 加400-440μL W5混匀,终止反应
18、 100g,2min 23℃离心,去上清,重复洗一次
19、 用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
20、 20-25℃孵育16h以上
21、 取样制片观察
溶液配制:
1、 酶解液的配制(20ml)
试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
MES | 20mM | 0.08528 | KOH调pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
KCl | 20mM | 0.02982 | |
macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
55℃水浴10min,待冷却后再加以下试剂 | |||
CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
BSA | 0.10% | 0.02 | |
W5溶液配制(500mL) | |||
试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
MES | 2mM | 0.19524 | KOH调pH5.7 |
NaCl | 154mM | 4.49988 | |
CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
KCl | 5mM | 0.186375 | |
MMG配制(100mL) | |||
试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
MES | 4mM | 0.078096 | KOH调pH5.7 |
D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 | |
PEG配制(10mL) | |||
试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
PEG 4000 | 40% | 4 | |
D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 | |
CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 |
苏州阿尔法生物提供的天根试剂盒包括植物dna提取试剂盒,土壤DNA提取试剂盒,质粒小提试剂盒,RNA提取试剂盒等,更多内容进入苏州阿尔法生物科研试剂采购平台了解。
免责声明
- 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。