Fluo-4 钙离子检测试剂盒的关键特性与优势

Fluo-4 钙离子检测试剂盒是一种基于 Fluo-4 AM 钙离子荧光探针的细胞内钙离子浓度检测工具。该试剂盒适用于多种检测方法，包括荧光显微镜成像、荧光酶标仪和流式细胞仪定量检测，还支持细胞内钙离子浓度的动态变化监测。Fluo-4 是 Fluo-3 的衍生物，将 Cl 离子替换为电子吸引力更强的 F 离子后，其最大激发波长较 Fluo-3 短约 10 nm，更接近氩激光器波长，使得 Fluo-4 在氩激光器激发下荧光强度更高，检测灵敏度也相应提升。

操作步骤详解

细胞准备与处理

• 细胞培养 ：选择合适的细胞类型进行培养，确保细胞处于良好的生长状态。将细胞培养在相应的培养基中，定期更换培养液，保证细胞的活力和正常代谢。

• 细胞计数与浓度调整 ：使用细胞计数板或自动细胞计数仪精确计数细胞，调整细胞浓度至实验所需范围，一般为

  $1 \times 10^5$

  -

  $5 \times 10^6$

  个 / mL，以确保标记效果和后续检测的准确性。

Fluo-4 AM 染料准备

• 染料配制 ：根据试剂盒说明书，将 Fluo-4 AM 溶于适当的无血清培养基或缓冲液中，配制成工作液，浓度一般为 1 - 10 μM。根据细胞类型和实验需求优化浓度，以避免浓度过高或过低对细胞造成影响或影响标记效果。

• 染料预热 ：将配制好的 Fluo-4 AM 工作液置于 37℃水浴中预热 5 - 10 分钟，以促进染料更好地穿透细胞膜，提高标记效率。

细胞标记过程

• 细胞与染料混合 ：将预热后的 Fluo-4 AM 工作液与细胞悬液按一定比例混合，轻轻吹打混匀，使细胞与染料充分接触。通常 Fluo-4 AM 与细胞的混合比例为 1:1 或根据实验需求调整。

• 标记孵育 ：将混合好的细胞与染料置于 37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时，使 Fluo-4 AM 充分进入细胞并被细胞内酯酶转化为 Fluo-4。孵育时间不宜过长，以免细胞因缺氧等原因提前凋亡或影响后续实验。

细胞洗涤与后续操作

• 洗涤去除未结合染料 ：孵育结束后，用预冷的含有血清的培养基洗涤细胞 2 - 3 次，以去除未结合的 Fluo-4 AM 染料。洗涤过程中动作要轻柔，避免细胞聚集或损伤。

• 细胞重悬与培养 ：将洗涤后的细胞重悬于适量的培养基中，调整细胞浓度至合适范围，进行后续实验。

结果检测与分析

荧光显微镜检测

• 显微镜设置与观察 ：在荧光显微镜下观察细胞的荧光标记情况，使用激发波长为 490 - 510 nm 的蓝光激发细胞，观察细胞内绿色荧光的分布和强度。Fluo-4 标记的细胞在受到刺激导致钙离子浓度升高时，荧光强度会显著增强。

• 动态变化监测 ：通过荧光显微镜的时间序列成像功能，可以实时监测细胞内钙离子浓度的动态变化。在细胞受到刺激后，观察荧光强度的变化情况，记录钙离子浓度的瞬时变化，分析细胞的信号传导过程。

荧光酶标仪检测

• 仪器设置与参数调整 ：使用荧光酶标仪检测细胞内钙离子浓度时，设置激发波长为 490 - 510 nm，发射波长为 520 - 540 nm。根据细胞荧光强度的不同，可以定量分析细胞内钙离子浓度的变化。

• 数据采集与分析 ：将标记好的细胞悬液加入到 96 孔板中，每个孔加入适量的细胞悬液。在荧光酶标仪上进行检测，采集荧光强度数据。通过分析荧光强度的变化，可以计算细胞内钙离子浓度的变化情况，评估细胞的活性和功能状态。

流式细胞仪检测

• 仪器设置与参数调整 ：使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度时，设置激发波长为 488 nm，检测绿色荧光（FL1 通道）。根据细胞荧光强度的不同，可以区分不同钙离子浓度的细胞群体。

• 数据采集与分析 ：将标记好的细胞悬液调整至适当浓度，一般为

  $1 \times 10^5$

  -

  $1 \times 10^6$

  个 / mL，通过流式细胞仪进行检测。采集荧光强度数据，通过分析细胞群体的荧光强度分布，可以评估细胞内钙离子浓度的异质性和动态变化。