TNF肿瘤坏死因子信号通路及功能作用介绍-赛默飞

TNF（肿瘤坏死因子）是什么？

细胞因子中的肿瘤坏死因子（TNF）超家族是一类多功能促炎细胞因子，可激活与细胞存活、凋亡、炎症反应和细胞分化相关的信号通路。通过两种受体 TNFR1（TNF 受体-1 或 CD120a）和 TNFR2（TNF 受体-2 或 CD120b）诱导对肿瘤坏死因子的细胞应答。TNFR1 在大多数人体组织中通过与 TNF α 结合而被激活。TNFR2 在免疫细胞中表达，并可被 TNFα 和 TNFβ 激活 [1]。Thermo Scientific™ 具有多种产品可帮助进行 TNF 研究。

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关键 TNF 通路靶点

TNF 与许多信号通路靶标相互作用，包括：

作为对炎症和感染的应答，促炎细胞因子 TNFα 由巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和角质形成细胞产生。TNFα 最初通过与细胞表面受体 TNFR1（p55）和 TNFR2（p75）结合而引发促炎信号。TNFR1 和 TNFR2 通过三种不同信号通路引发细胞对 TNFα的应答，导致 caspases 激活以及 AP-1 和 NFκB 转录因子的激活 [2]。激活 TNFα 导致 TNFR1 受体发生三聚化以及位于 TNFR1 蛋白胞质区的死亡结构域的结合。

死亡结构域的聚集引起 TRADD（TNFR 相关死亡结构域）衔接蛋白的募集。其他 TRADD 介导的 FADD（Fas 相关死亡结构域）、RAIDD（具有死亡结构域的 RIP 相关 ICH-1/CED-3 同源蛋白）、MADD（MAPK 激活死亡结构域）和 RIP（受体相互作用蛋白）的募集诱发激活 caspase 8。Caspase 8 介导一系列受调节的蛋白切割事件，最终导致细胞凋亡。

caspase 8 对 BID（BH3 相互作用死亡结构域）切割产生 tBID（截短型 BID），导致线粒体膜破坏和细胞色素 C（CytoC）的释放。CytoC 与 APAF1（凋亡蛋白酶激活因子-1）结合使得 caspase 9 被募集，caspase 9 切割 caspase 3 产生其活性形式。XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis，X 连锁凋亡抑制蛋白）可抑制该信号通路中此阶段 caspase 的激活。

TRAF2（TNF 受体相关因子-2）与 TRADD 的结合介导转录因子 AP-1 和 NFκB 通过 TNF 信号转导的激活，从而与 MADD 和 RIP 形成激活的复合物。该复合物与 NIK（NF-κB-诱导激酶）结合后可磷酸化 IκK，此时，NFκB 易位至细胞核，引发 IκB 降解 [3]。TNFR1、TRADD、TRAF2、MADD、RIP 复合物（Jun NH2-末端激酶）可激活 MAPK，由此可激活 AP-1 转录复合物。AP-1 是许多应激和生长相关基因转录激活所必需 [4]。

TNF信号通路数据

Thermo Scientific™ 为 TNF 信号通路中的关键靶点提供抗体、ELISA、Luminex 多重检测和生长因子。

以下是使用 Thermo Scientific™ 产品的 ELISA 和流式细胞分析数据。

用浓度为10 μg/mL 的抗牛 TNF-α 多克隆抗体（产品编号 PBOTNFAI）以100 µL/孔进行包被，并在 4℃ 下孵育过夜，进行 TNF-α 的 ELISA 分析。使用在 PBST 中稀释的3%牛血清白蛋白（BSA）封闭孔板1小时。用200 µL/孔 PBST 洗涤孔板6次，然后在室温下以100 µL/孔重组牛 TNF-α 蛋白标准品和组织培养上清液中的重组绵羊 TNF-α（均以未知浓度开始的按照 Log2 稀释的稀释液）孵育1小时。用洗涤缓冲液将孔板洗涤6次，并在室温下用浓度为1 µg/mL 的抗牛 TNF-α 生物素偶联多克隆抗体（产品编号 PBOTNFABI）以100 µL/孔孵育1小时。用洗涤缓冲液将孔板洗涤6次，然后使用2 µg/mL 的 HRP-偶联链霉素亲和素在室温下扩增信号1小时。以100 µL/孔使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）检测10分钟。用 0.2M 硫酸终止反应。在分光光度计上于450 nm 处读取吸光度（光密度 [OD] 值）。

C57BL/6 脾细胞未进行刺激，或者在存在布雷非德菌素 A 的情况下，使用佛波醇肉豆蔻酸酯（PMA）和离子霉素对 C57BL/6 脾细胞刺激5小时。然后用抗小鼠 CD4 FITC（产品编号 MCD0401）对细胞进行表面染色，随后使用 FIX & PERM 细胞透化试剂盒（产品编号 GAS003 或 GAS004）进行固定和透化，并用抗小鼠干扰素 γ（IFN-γ）PE-Cy7 偶联物（产品编号 A18713）和抗小鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）PPacific Blue™ 偶联物（产品编号 RM90128）进行细胞内染色。使用 Attune 声波聚焦流式细胞仪（蓝色/紫色）采集样品，采用488 nm 激发和530/30 nm 带通发射滤光片检测 FITC，采用640 nm 长通滤光片检测 PE-Cy7 偶联物。使用405 nm 激发和450/40 nm 带通发射滤光片检测 Pacific Blue™ 荧光。图 A：在存在布雷非德菌素 A 的情况下，未进行刺激（左图）或用 PMA 和离子霉素刺激（右图）的总小鼠脾细胞的 IFN-γ 和 TNF-α 共染色。图 B：用上述条件刺激后 CD4 T 细胞表达 TNF-α（左图）和 IFN-γ（右图）。

TNF信号通路有何功能？

TNF 信号传导通路在各种生理和病理过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、分化、细胞凋亡和免疫反应调节以及炎症诱导。TNF (肿瘤坏死因子) 是一种多功能促炎细胞因子，可对脂质代谢、凝血、胰岛素抵抗和内皮功能产生影响。自从 20 年前被发现以来，TNF 就一直被认为是一种抗癌剂。TNFR (TNF 受体) 超家族的成员可向细胞发出存活和死亡信号。

TNF 通过两种受体 TNFR1 (TNF 受体-1) 和 TNFR2 (TNF 受体-2) 发挥作用。TNFR1 由所有人类组织表达，是 TNF α 的主要信号传导受体。TNFR2 大多在免疫细胞中表达，并介导有限的生物反应。TNFR2 可结合 TNF α 和 TNF β (1,4)。

TNF α 通路

TNF α 是一种促炎细胞因子，由多种细胞类型产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，应对炎症、感染和其他环境压力。TNF α 可一系列不同的生物学效应，因细胞类型诱导而异。TNF α 通过在细胞表面与其受体 TNFR1 (p55) 和 TNFR2 (p75) 结合来起作用。大多数细胞都表达 TNFR1 ，后者被认为是 TNF α 细胞毒性的主要介体 (3 ， 5)。TNF α 与其两种受体 TNFR1 和 TNFR2 结合，导致信号传导子募集，至少活化三种不同的效应子。通过复杂的信号级联和网络，这些效应子会激活半胱天冬酶以及两种转录因子：活化蛋白-1 和 NF-κB (核因子-KappaB)。最初，TRADD (TNFR 相关死亡结构域) 蛋白与 TNFR1 结合。然后， TRADD 募集 FADD (Fas 相关死亡结构域、RAIDD (RIP 相关 ICH-1/CED-3-同源蛋白伴有死亡结构域)、madd (MAPK 活化死亡结构域) 和 RIP (受体相互作用蛋白)。TRADD 和 FDD 与 TNFR1 结合可导致半胱天冬酶 8 的募集、低聚和激活。活化的半胱天冬酶 8 随后启动蛋白水解级联，包括其他半胱天冬酶 (半胱天冬酶 3, 6 和 7)，并最终诱导细胞凋亡。半胱天冬酶 8 也裂解 BH3 (相互作用死亡结构域)。tBID (截短型) 可破坏外线粒体膜，导致促凋亡因子细胞 C (细胞色素-C) 的释放。从膜间空间释放的细胞因子 C 与 APAF1 (凋亡蛋白酶激活因子-1) 结合，后者可募集半胱天冬酶 9，而蛋白则可水解激活半胱天冬酶 3。新型 61-kDa 蛋白激酶 RIP2 与 RIP 有关，后者是 TNFR1 的组分，介导半胱天冬酶死亡蛋白酶的募集。RIP2 过表达同时发出 NF-KappaB 活化和细胞死亡的信号 (3, 5-9)。

利用 TNF RAF-2 活化信号传导通路

TRAF2 (TNF 受体相关因子-2) 参与两条不同的通路的激活，这些通路可通过 JNK (JUN NH2-末端激酶)、MEKK (MEK 激酶)、p38 以及 RIP 一起导致激活蛋白-1 的激活、， 还通过 NIK (NF- κ B 诱导激酶)激活 NF-κB 活化。已证明 TNF α 可激活 MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)：ERK1 和 ERK2 (细胞外信号调节激酶)。过表达 SODD (死亡域沉默子) (一种与 TNFRI DD 相关的 60 kDa 蛋白)，可抑制 TNF 诱导细胞死亡和 NF-κB 活化，证明其作为这些信号传导通路的阴性调节蛋白发挥作用。

TNF β 与 TNFR2 的相互作用

TNFR2 是 TNF β 的受体。TNF β 由活化的淋巴细胞产生，且可能对许多肿瘤和其他细胞具有细胞毒性。在中性粒细胞、内皮细胞和破骨细胞中，TNF β 可导致活化，而在许多其他细胞类型中，它还可导致 MHC 和粘附分子的表达增加。

TNF信号通路传导的影响

TNF 信号通路与多发性硬化、阿尔茨海默病以及 TRAPS (TNF 受体相关定期综合征)等相关。对 TNF 及其相关物的更好地了解，最终应该导致开发出小分子，后者可成功抑制和调节这些细胞因子的生物活性，从而为治疗干预提供新的途径。

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参考文献

1. Kawasaki H. et al.(2002) Identification of genes that function in the TNFα-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries.Nat Biotechnol 20: 376-80.

2. Kagoya, Y. et al.(2014) Positive feedback between NF-κB and TNF-α promotes leukemia-initiating cell capacity.J Clin Invest 124(2): 528-542.

3. Baud V. et al.(2001) Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives.Trends Cell Biol 11: 372-7.

4. Kai-Li He. et al.(2002) A20 Inhibits Tumor necrosis factor (TNF) α-Induced apoptosis by disrupting recruitment of TRADD and RIP to the TNF receptor 1 complex in jurkat T cells.Mol Cell Biol 22: 6034-6045.

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