凝胶色谱仪（GPC/GFC）是蛋白质纯度分析与聚集体检测的核心工具，其核心原理基于分子筛效应：大分子因无法进入凝胶孔隙而快速流出，小分子则因深入孔隙而延迟洗脱，从而实现分子量依赖的分离。以下是具体解析方法：
一、蛋白纯度分析
分离机制
使用葡聚糖（Sephadex）或琼脂糖（Sepharose）填料构建凝胶柱，流动相为低离子强度缓冲液（如PBS）。
目标蛋白与杂质（如宿主细胞蛋白、核酸）因分子量差异被分离，纯蛋白在单一峰中洗脱，杂质形成肩峰或拖尾。
纯度评估
峰面积积分：通过紫外检测器（UV280nm）计算目标蛋白峰面积占比，纯度=目标峰面积/总面积×100%。
标准品对比：与已知纯度的蛋白标准品（如BSA）共跑，对比保留时间与峰形一致性。
二、聚集体检测
聚集体形成机制
蛋白质在储存、运输或高温条件下易发生二硫键交换、疏水相互作用，形成二聚体、寡聚体甚至可溶性聚集体。
检测方法
多角度光散射（MALS）联用：实时监测分子量变化，聚集体表现为保留时间提前且分子量显著增大（如单体50kDavs二聚体100kDa）。
峰形分析：聚集体导致峰形不对称（前延或拖尾），通过第二维分析（如SEC-MALS）可定量聚集体比例。
案例
某单抗药物在40℃储存后，凝胶色谱图显示主峰前出现肩峰，MALS检测到20%二聚体，证实高温导致聚集。
三、技术优化
柱效提升：使用小粒径填料（如3μm）提高分辨率，缩短分析时间至15分钟。
溶剂兼容性：选择pH耐受范围广的凝胶（如Superdex200Increase），避免蛋白变性。
自动化：结合液相色谱系统（如AKTA），实现梯度洗脱与在线浓度监测。
凝胶色谱仪通过分子量依赖的分离机制，可直观解析蛋白纯度与聚集体水平，为生物制药质量控制提供关键数据支持。
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