Biotin-Hyodeoxycholic acid，生物素标记猪去氧胆酸的特点

一、基本信息

1. 分子组成与结构

• 猪去氧胆酸（Hyodeoxycholic Acid, HDCA）

• 是一种天然胆汁酸，化学名为 3α,6α- 二羟基 - 5β- 胆烷酸，分子式为 $C_{24}{H}_{40}{O}_4$，分子量 392.57。

• 结构特点：具有甾核骨架，3 位和 6 位羟基（-OH）、17 位戊酸侧链，分子呈两亲性（疏水性甾环 + 亲水性羟基），参与脂类消化、肝肠循环及信号通路调控（如激活 FXR、TGR5 受体）。

• 生物素标记原理
  通过化学偶联将生物素（维生素 H）连接至 HDCA 的羟基、羧基或氨基（需引入氨基修饰），形成生物素 - 胆汁酸共轭物，保留 HDCA 的生物活性并赋予其亲和素靶向识别能力。

二、制备方法

1. 关键步骤与试剂

（1）HDCA 的活化

• 羧基活化（针对 17 位戊酸侧链）：

• 试剂：碳化二亚胺（如 EDC）+ N - 羟基琥珀酰亚胺（NHS），形成 NHS 酯中间体，便于与生物素氨基反应。

• 反应式：$\text{HDCA-COOH}+\text{EDC/NHS}\to \text{HDCA-NHS酯}+\text{EDC副产物}$

• 羟基活化（针对 3α/6α 羟基）：

• 试剂：甲磺酰氯（MsCl）或对甲苯磺酰氯（TsCl），将羟基转化为磺酸酯（-OTs/-OMs），再与生物素氨基发生亲核取代反应。

（2）生物素偶联

• 生物素衍生物选择：

• 生物素 - 氨基（Biotin-NH₂）：与活化的 HDCA 羧基（通过 NHS 酯）或磺酸酯（羟基活化后）反应，形成酰胺键或醚键。

• 生物素 - 马来酰亚胺（Biotin-Maleimide）：若 HDCA 经修饰引入巯基（-SH），可通过硫醚键偶联。

• 典型反应条件：

• 溶剂：DMSO/DMF（助溶 HDCA），pH 7.5-9.0（弱碱性促进氨基反应），室温搅拌 2-6 小时。

（3）纯化与表征

• 纯化：硅胶柱层析（氯仿 - 甲醇梯度洗脱）或制备型 HPLC（反相柱，流动相含 0.1% 甲酸水溶液 - 乙腈）。

• 结构验证：

• 质谱（MS）：ESI-MS 检测分子离子峰（[M+H]+ 或 [M-H]-），确认生物素（分子量 244.31）与 HDCA 的加合。

• 核磁共振（NMR）：¹H-NMR 观察生物素咪唑环（δ≈7.0-7.5 ppm）或侧链亚甲基（δ≈1.0-2.5 ppm）特征峰。

三、特性与优势

1. 双功能分子特性

• 胆汁酸生物活性保留：标记后仍能结合 FXR/TGR5 受体，调控脂质代谢、炎症反应等通路，适用于受体介导的机制研究。

• 生物素靶向性：通过亲和素 - 生物素高亲和力结合（Kd≈10⁻¹⁵ M），实现对 HDCA 的追踪、捕获或信号放大。

2. 高稳定性与兼容性

• 甾核结构刚性强，生物素连接键（如酰胺键、醚键）在生理条件下不易断裂，适合体内外长时间孵育实验（如细胞成像、动物活体追踪）。

• 可兼容多种检测技术：荧光标记亲和素（如 Alexa Fluor 系列）、酶标亲和素（HRP/AP）或磁珠偶联亲和素，满足不同实验需求。

3. 应用灵活性

• 小分子探针：用于研究 HDCA 的肝肠循环路径、细胞摄取机制（如肝细胞 / 肠道上皮细胞转运体识别）。

• 药物载体组件：与纳米颗粒（如脂质体、聚合物胶束）结合，利用胆汁酸的肝靶向性（肝细胞高表达胆汁酸转运体）和生物素亲和性，实现肝部疾病的双重靶向给药。

四、应用领域

1.胆汁酸代谢与信号通路研究

• 受体结合分析：通过生物素标记 HDCA 进行亲和层析，钓取细胞内 FXR/TGR5 受体或其他互作蛋白，阐明 HDCA 调控代谢的分子机制。

• 肝肠循环追踪：在动物模型（如小鼠）中注射标记物，利用亲和素磁珠从胆汁、粪便或血浆中捕获 HDCA，定量分析其排泄与重吸收效率。

2. 分析检测技术

• ELISA 检测：作为竞争抗原，检测生物样品中内源性 HDCA 或外源性药物浓度。

• 免疫荧光成像：标记物与荧光亲和素联用，在组织切片或活细胞中可视化 HDCA 的分布（如肝细胞内吞囊泡定位）。

3. 肠道微生物互作研究

五、注意事项

1. 标记位点对活性的影响

• 优先选择非活性位点连接生物素：如 17 位羧基（远离羟基功能团），避免影响 HDCA 与受体的结合能力。通过分子对接模拟验证标记后构象变化。

2. 溶解性优化

• HDCA 水溶性差（≈0.1 mg/mL），标记反应需使用有机溶剂（如 DMSO≤10%），并在后续实验中逐步稀释至生理环境，避免细胞毒性。

3. 体内实验安全性

• 在动物研究中需评估标记物的毒性：生物素本身毒性低，但共轭物可能因分子量增大影响肝肾功能，建议通过血生化指标（如 ALT、AST）监测。

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