在 WB 过程中从 SDS-PAGE 胶上转移蛋白至膜上是非常关键的步骤！优化转移时间往往需要实验多次，下面就讲几条关于如何保证蛋白*转移的小技巧，适合新手参考 :

使用预染的 marker 预染 marker 不仅能够直观的观察到跑胶情况，而且在转移过程中也是很好的工具，在完成印迹后观察膜上的 marker ，看是否所有条带都已经转移至膜上。

在转印装置中加两块膜 小分子量的蛋白转移的比较快，而为保证大分子蛋白的转印，长时间的转印可能使小分子蛋白透过膜，因此，可以加入两块膜，如果能在第二块膜上检测到小分子蛋白，说明转印时间过长。

在转印后对胶染色 如果转印时间不够优化，通过对胶染色，在胶上能够观察到未转移*的蛋白，这种情况在转印大分子蛋白是常见，使用银染或者考马斯亮蓝的方法都可以。

二、 Western blot 转印的优化

从 SDS 凝胶中进行 Western 蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行转印需要一定程度的优化，尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。

转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时使用第二个 " 支持膜 " ，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差，可以考虑下列因素：

SDS vs 甲醇

在多数转印实验步骤中都使用 SDS 和甲醇。但两者对于成功的转印有相反的作用，需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。

SDS 对于蛋白的迁移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用， SDS 过多会抑制结合，尤其对于硝酸纤维素膜。作为一个一般性的规则，如果膜的结合力有效，但蛋白仍旧残留在凝胶上，在转印缓冲液中加入 0.1 ％ SDS 会促进*转印。但另一方面，甲醇通过在蛋白上剥离 SDS ，促进蛋白和膜的疏水结合。一般在转印缓冲液中加入 20 ％的甲醇会增加硝酸纤维素膜的结合能力。

凝胶浓度

丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度zui低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。

凝胶厚度

蛋白比较易于从薄胶上转移下来，所以如果上样体积允许，使用 1.0mm 厚的胶取代 1.5mm 的胶。

电场（电压 × 时间）

如果电压过低而且转印时间过短，部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高，小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上，增加电压可能会有帮助，但不要超过 5V 。

膜的类型

蛋白结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。 PVDF 膜比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的 SDS 。目前， PVDF 膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件，其适用于蛋白印迹。尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合，其 SDS 耐受度甚至高于 PVDF 膜，但也需要更严谨的封闭条件，主要建议用于 Northern 和 Southern 。