1质粒DNA提取

提取质粒的时候，zui后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，是空调吹热风，或是 37 度温箱放长一点的时间，我试过室温经过一夜，酶切很好。

将 amp 浓度提高到 200ug/ml ，下班前接种，次日一早收获菌体，此时 OD 虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积（管数）也小（少）。

手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。

2Western Blot

做 western blot 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实*没有必要这样。一次转膜后，将 PVDF 膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。

做 western blot 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染 maker 条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染 maker 很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染 maker 后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防 maker 失去参照价值。

器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗 2 － 3 遍，然后用去离子水冲洗一遍。zui后用 95 ％酒精再擦一遍后晾干备用。

配胶现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加 APS 并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入 1 － 2 次即可。

3缓冲液和培养基配置

（ 1 ）将缓冲液配方中的成分分别以 10-100 倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可；

（ 2 ）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配 LB 时的三个成分不记得到底哪个是 5g ，哪个要 10 个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配 LB 时，在 NaCl 瓶外注明 10 g/L ， yeast 5 g/L ， tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。

4PCR

在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行 PCR 鉴定，每次配置 PCR 反应液很繁琐，可以将其配置类似 kit 的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大 100 倍配置 100× 主反应液（ 100 次反应），其中含 buffer ， Mg2 ＋， dNTPs ，但不含引物和 Taq 酶，然后可以 10× 分装或一管储存在－ 20 度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的 PCR 反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的 Taq 和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：

（ 1 ）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球；

（ 2 ）避免每次反应加样不均的可能；

（ 3 ）大大减少 PCR 假阳性的产生。

5酶切

如果是要做酶切，提质粒的zui后一步是用水溶解 DNA ，因为 TE 里面的离子会影响酶切的效率。

双酶切制备克隆插入片段的载体，选择带有外源片段的质粒，是否酶切*，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切*和双切*在分子量上差异不大。

在做酶切时，也可以象 PCR 一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入 buffer 、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒 DNA 的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒 DNA 酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有 10 几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：

（ 1 ）各反应成分均一；

（ 2 ）可大大减少限制型内切酶的使用；

（ 3 ）节省时间。

6大肠杆菌转化实验

有时候*天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（ 1~2 毫米以上， BL21 就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基）， 50 微升酚 / 氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加 40 微升 TE 抽提，上层 TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层 TE 即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省 6~8 小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。

转化时一定要做一个宿主菌的对照，即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于 BL21 可以在 Amp （ + ）的平板上面生长。

7蛋白质的表达、分离、纯化

当蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，zui有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些方法复性率也可以达到 60 ％以上。

8PCR扩增产物的克隆

引物设计主要是要注意以下几个事项：

（ 1 ）发夹结构；

（ 2 ）反向配对；

（ 3 ） GC 含量（ 40 － 60% ）；

（ 4 ）退火温度（ 45 － 65 度）；

（ 5 ）引物长度（ 18 － 27bp ）；

（ 6 ） 3' 端是 C 、 G （提高结合度）；

（ 7 ）引物在序列中的错配位点。

大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是 3' 端不能形成发夹结构。

那么你说你这段能不能设计引物呢？其实设计引物都只是好中选优的问题。

9细胞冻存和复苏实验

（ 1 ）可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到 1 小时，这样温度和 ph 值都已经细胞生长了。

（ 2 ）为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下 1 百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间 handle 这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释 DMSO 。常温下高浓度 DMSO 对细胞的损害比较大。

（ 3 ）水浴温度 40 ℃ 应该也没问题，但正规的 protocol 上从来都只说 37 ℃ 。反正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般zui多水浴不超过 1.5 分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。

10逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

（ 1 ） RT-PCR 有两种做法

条件具备的话可用 kit 进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR 。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行，当然也可能是我买的 kit 不太好。（ promega ）。

（ 2 ） RT-PCR 应具备的条件

高质量的 RNA （保留后可做 5‘ ， 3’RACE ）；引物的（产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以及内标分子的表达量调整的*一样）；体系的均一性等。

（ 3 ） RACE

我做过 RACE （ 3’RACE 是宝生物的 Kit ； 5‘RACE 是 Gibico ），但现在再进行另一个同源基因的 3‘RACE 时却怎么也 P 不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（ RACE 的方法），而另一个基因的 3’UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的 3‘UTR 太长的缘故。

（来源：丁香园）

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