二十六、 双向凝胶电泳（2-DE）

双向凝胶电泳的原理是*向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

二十七、mRNA的分离与纯化（ 寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA）

真核细胞的mRNA分子zui显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法zui为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

二十八、His-tag纯化蛋白

His•Tag序列（6、8或10个连续的组氨酸残基）与固定在基于NTA(氮川三乙酸镍) -和IDA- 的His•Bind树脂上的二价阳离子Ni2+结合。洗去未结合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件，或存在6M胍或尿素条件下纯化蛋白。

二十九、 RNA酶保护试验方法 (RNase Protection Assay，RPA)

RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。与Northern blot和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。

三十、免疫组化

三十一、各种分子标记技术的比较

限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是zui早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定片段DNA的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其*的检测DNA多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增片段DNA,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生片段DNA插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。

扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量片段DNA,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。

SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为2～6个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中zui常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入 ,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景的遗传标记。