十一、 BCA法测蛋白质浓度

十二、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备

1、前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养到第二日（约16小时）；

2、取1ml已培养到第二日的培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3、将0.1M CaCl 2 溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；

4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

6、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；

7 、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；

8 、 弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9 、 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

十三、 碱变性提取质粒DNA

碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会*分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去 。

十四、 目的基因的连接、转化及克隆筛选

（1） 总过程：

分---PCR分离目的基因

切---限制性内切酶切割

接---目的基因与载体相连

转---转入宿主细胞

筛---筛选阳性重组体

（2） 分---PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选

（3） 切---限制性内切酶切割：粘性末端、平末端

（4） 接---目的基因与载体相连

原 理：利用DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性和利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接。

（5）转---转入宿主细胞

感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。

（6） 筛---筛选阳性重组体

十五、RNA干扰（RNAi）

一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。