精品视频一区二区三区 细胞铺板具体操作及流程

细胞铺板是细胞实验中的基础操作，其目的是将细胞均匀分布在培养板上，以保证实验结果的准确性和可重复性。下面为你介绍详细操作流程：

1.实验准备

材料：细胞悬液、培养基、胰酶、PBS 缓冲液、血清、96 孔板或 24 孔板等培养板。

器材：移液器及配套枪头、离心机、细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜。

试剂配制：提前配制好含 10% 血清的培养基，若细胞贴壁性差，还需用多聚赖氨酸对培养板进行包被处理，即将适量多聚赖氨酸溶液加入培养板各孔，室温孵育 1-2 小时，吸去溶液，用 PBS 冲洗 2-3 次，晾干备用。

2.细胞悬液制备

取出细胞：从培养箱中取出长满细胞的培养瓶，在超净工作台内，用移液器吸去瓶内旧的培养基。

清洗细胞：向瓶内加入适量 PBS 缓冲液，轻轻晃动培养瓶，润洗细胞 1-2 次，以去除残留培养基及杂质，吸去 PBS。

消化细胞：加入适量胰酶溶液，覆盖细胞层，将培养瓶置于显微镜下观察，当细胞开始变圆、脱离瓶壁时，立即加入含血清的培养基终止消化。血清中的蛋白可中和胰酶活性，防止过度消化。

吹打细胞：用移液器反复轻柔吹打细胞层，使细胞全部分散成单细胞悬液。吹打过程要控制力度，避免产生过多气泡损伤细胞。

离心收集：将细胞悬液转移至离心管，以 1000-1500 转 / 分钟的速度离心 3-5 分钟，使细胞沉淀在管底。

重悬细胞：吸去上清液，加入适量新鲜培养基，用移液器轻柔吹打，将细胞重悬，制成均匀的细胞悬液。

3.细胞计数

稀释细胞悬液：取少量细胞悬液，用培养基按 1:1 或 1:2 的比例稀释，避免细胞浓度过高难以计数。

加载细胞悬液：将稀释后的细胞悬液滴加在血细胞计数板的计数区，注意不要产生气泡，盖上盖玻片。

计数细胞：在显微镜下，计数计数板四个大格内的细胞总数。压线细胞遵循 “计上不计下，计左不计右" 原则，避免重复计数。根据公式计算细胞浓度：细胞浓度（个 /mL）=（四个大格细胞总数 / 4）× 稀释倍数 ×10^4 。

4.细胞铺板

计算铺板体积：根据实验需求和培养板规格，确定每孔所需细胞数量。如 96 孔板每孔一般接种 5×10^3 - 2×10^4 个细胞，24 孔板每孔接种 5×10^4 - 2×10^5 个细胞。根据细胞浓度计算所需细胞悬液体积，如细胞浓度为 1×10^5 个 /mL，96 孔板每孔需接种 1×10^4 个细胞，则每孔需加入细胞悬液体积为 100μL。

铺板操作：用移液器吸取计算好体积的细胞悬液，加入培养板相应孔中。从培养板一侧边缘开始，逐孔加入，避免液体溅出和产生气泡。加样过程中，若需接种多块板，应保持移液器操作一致，确保每孔细胞数量均匀。

轻柔混匀：加样完成后，将培养板在水平桌面上轻轻晃动，或使用平板振荡器，低速振荡 1-2 分钟，使细胞在孔内均匀分布。注意振荡幅度不宜过大，以免细胞聚集。

5.培养观察

放入培养箱：将铺好细胞的培养板放入 37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。CO₂可维持培养基 pH 值稳定。

定期观察：培养 2-4 小时后，在倒置显微镜下观察细胞贴壁及分布情况。若发现细胞分布不均，可轻微调整培养板位置，继续培养。后续每天定时观察细胞生长状态，包括细胞形态、密度等，为后续实验做准备。

细胞铺板过程需严格遵守无菌操作原则，动作轻柔，确保细胞活性及分布均匀性，这样才能保证实验顺利进行。

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