一、血小板冻干设计规划

1. 预处理与保护剂选择

保护剂：采用二糖联合 DMSO ，通过 37 ℃孵育 4 小时负载至胞内，提高冻干存活率。

抑制剂：添加可逆性激活抑制剂（如 PGE-1 、腺苷），减少冻干前血小板自发活化。

2. 预冻参数优化

冻结速率设计： 20 ℃ /min 降至 -40 ℃，预冻速率设计；

退火处理：以 1-1.5 ℃ /min 升温至 -30 或 -35 ℃，维持 0.5 小时，减少冰晶形成。

3. 冻干工艺

一级干燥：板层温度 -20 ℃ /-40 ℃，真空度≤ 1Pa ，持续 24-72 小时；

二级干燥：升温至 15 ℃（ Tg 以下），真空度≤ 1 Pa ，持续 2-6 小时。

二、 CD34 干细胞冻干设计规划

1. 细胞动员与采集

使用集落刺激因子（ G-CSF 或 GM-CSF ）联合化疗药物（如环磷酰胺）动员外周血干细胞，确保 CD34+ 细胞浓度≥ 5 × 10^6/kg 。

2. 冻干前处理

离心洗涤：去除血浆及杂质，重悬于含 10% FBS 的培养基；

保护剂添加：二糖 + DMSO ， 4 ℃缓慢渗透（ 5-45 分钟）。

3. 冻干参数

预冻： -80 ℃超低温预冻过夜，或液氮速冻（ -196 ℃）；

干燥：冷阱温度 -85 ℃，板层温度梯度升至 -30 ℃ /-20 ℃，真空度≤ 1 Pa ，持续 24-72 小时。

冻干后活性及关键指标设定

一、血小板冻干后指标

1. 功能活性

聚集功能：对凝血酶（ 1 U/mL ）、 ADP （ 20 μ mol/L ）的最大聚集率≥ 70% ；

活化标志物： CD62p 表达率≤ 40% ， PAC-1 表达率≤ 5% （流式细胞术检测）。

2. 形态学评估

扫描电镜显示细胞膜完整，无明显冰晶损伤。

3. 促凝血功能

凝血酶时间（ TT ）与新鲜血小板差异＜ 10% 。

二、 CD34 干细胞冻干后指标

1. 细胞活性

存活率：冻干后细胞存活率≥ 70% （台盼蓝染色）；

CD34+ 细胞比例：≥ 2 × 10^6/kg （流式细胞术检测）。

2. 分化潜能

髓系分化：在体外分化培养后， CD11b+ 细胞比例≥ 30% ；

淋巴系分化： CD19+ 细胞比例≥ 15% 。

3. 植入率

移植后外周血 CD34+ 细胞水平恢复至≥ 0.5 × 10^6/kg （临床移植标准）。

血小板 &CD34 干细胞冻干设计细节要求

冻干工艺要求

一、血小板冻干要求

1. 保护剂与抑制剂

保护剂需预过滤（ 0.22 μ m ），避免颗粒污染；

抑制剂（如 PGE-1 ）需在无菌条件下添加。

3. 复水验证

复水后血小板回收率≥ 50% ，体积恢复率≥ 90% 。

二、 CD34 干细胞冻干要求

需针对其生物学特性设计工艺，核心要求包括保护剂优化、冻干参数精准控制及活性指标验证。

总结：血小板需重点保障聚集功能与活化水平，而 CD34 干细胞需关注细胞活性及分化潜能。需结合实际进行保护剂赋型剂及抑制剂的开发。