ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒使用说明

产品简介

ProteanFect CRISPR Ultra 转染试剂盒专为难转细胞系的基因编辑设计，采用自组装蛋白纳米颗粒技术，属于非病毒、非电转、非脂质体转染试剂。其通过高效递送 RNP（Cas9 蛋白与 guide RNA）至细胞内，实现安全、高精度的基因编辑。

试剂盒储存与成分说明

试剂盒通过干冰运输，收到后需立即存放于 -80℃。各组分存储条件如下：

• Reagent A（PT07）：开封后保存于 2-8℃。

• Reagent B（PT07）：保存于 -20℃，避免反复冻融。

• Cas9 蛋白（1 µg/µL）：保存于 -80℃，避免反复冻融。

• EGFP mRNA（1 µg/µL）阳性对照：保存于 -80℃，用于验证转染效率。

• Human TRAC-sgRNA（1 µg/µL）阳性对照：保存于 -80℃，靶向序列为 TGTGCTAGACATGAGGTCTA。

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实验前材料准备

• 待转染细胞：活性需 > 90%，推荐使用生长状态良好的细胞。

• 培养基：Opti-MEM 或无血清培养基（如 RPMI 1640、DMEM），使用前预热至室温。

• 转染试剂：室温解冻后颠倒混匀，确保溶液均一。

• 其他材料：完·全培养基、无菌 EP 管、待转染的核酸样品。

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操作步骤（以 96 孔板为例）

1. 配置转染体系（全程冰上操作）

• 步骤 1.1：在 40 µL Reagent A 中加入 0.8 µg（约 5 pmol）Cas9 蛋白和 0.3 µg（约 10 pmol）sgRNA，充分混匀。

• 步骤 1.2：加入 1.4 µL Reagent B，移液枪吹打 20-30 次或涡旋 10 秒混匀。

2. 细胞处理

• 悬浮细胞：离心（300 g，5 分钟）弃上清，用 Opti-MEM 重悬至浓度 5×10⁶ - 1×10⁷ cells/mL。

• 贴壁细胞：转染前汇合率保持 50%-80%，用 Opti-MEM 轻柔清洗两次，每孔加入 20 µL Opti-MEM 备用。

3. 细胞转染

• 步骤 3.1：将转染体系与 20 µL 细胞悬液混合（贴壁细胞直接加入孔板）。

• 步骤 3.2：37℃ 孵育 45-60 分钟（部分细胞可延长至 2 小时）。

• 步骤 3.3：加入 200 µL 完·全培养基终止反应，离心弃上清（贴壁细胞直接换液）。

• 步骤 3.4：继续培养 72 小时后检测基因编辑效率。

注意事项：

• 转染体系若出现轻微粘稠属正常现象，需置于冰上或 30 分钟内使用。

• EGFP mRNA 阳性对照操作：步骤 1.1 中加入 0.5 µg EGFP mRNA，其余步骤相同，转染后 5-48 小时观察荧光表达。

不同孔板规格的组分用量推荐

• 96 孔板：Reagent A 40 µL，Cas9 蛋白 0.8 µg，sgRNA 0.3 µg，Reagent B 1.4 µL，细胞数 1×10⁵ - 2×10⁵（20 µL 悬液）。

• 48 孔板：Reagent A 80 µL，Cas9 蛋白 1.6 µg，sgRNA 0.6 µg，Reagent B 2.8 µL，细胞数 2×10⁵ - 4×10⁵（40 µL 悬液）。

• 24 孔板：Reagent A 200 µL，Cas9 蛋白 4 µg，sgRNA 1.5 µg，Reagent B 7 µL，细胞数 4×10⁵ - 1×10⁶（100 µL 悬液）。

• 12 孔板：Reagent A 600 µL，Cas9 蛋白 7.5 µg，sgRNA 4.5 µg，Reagent B 21 µL，细胞数 1×10⁶ - 3×10⁶（300 µL 悬液）。

• 6 孔板：Reagent A 800 µL，Cas9 蛋白 16 µg，sgRNA 6 µg，Reagent B 28 µL，细胞数 2×10⁶ - 4×10⁶（400 µL 悬液）。

备注：大体系（≥600 µL）需在离心管中涡旋混匀后孵育。

数据分享

使用 Human TRAC-sgRNA 阳性对照转染 Jurkat 细胞后，72 小时检测 TRAC 基因编辑效率：

• 测序分析（图 1）：靶点基因编辑比例为 63.4%（PCR 引物：正向 GCAGTATTATTATTAAGTAGCCCT，反向 AACAAGGCTCACTGTTTTCTT）。

• 统计结果（图 2）：阳性对照组平均编辑效率为 63.9%。

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