B-arr2 招募细胞测定通过 GPCR 激活监测 B-arrestin 2 和 AP2 的招募。B-arr2 招募试剂盒用于通过监测内源性 B-arrestin 2 与其伴侣 AP-2 之间的相互作用来表征化合物对 Beta 抑制蛋白信号通路的影响。
从文献中得知，在研究 GPCR 背景下的 Beta 抑制蛋白信号通路时，对这种相互作用的药理学研究是相关的。
B-arr2 募集测定监测细胞中 GPCR 激活介导的 B-arrestin 2 募集。Cisbio 的 B-arr2 招募试剂盒具有高度敏感性，可对涉及内源 B-arrestin 2 和 AP2 蛋白的化合物进行药理学表征。该试剂盒使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体偶联。两种抗体对 B-arr2 蛋白和 AP2 均具有高度特异性。当细胞中存在 B-arr2/AP2 相互作用时，添加这些缀合物会使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中存在的 B-arrestin 2/AP2 复合物的数量成正比。
使用 HTRF 试剂检测 B-arr2 招募可以在用于培养、刺激、稳定和检测的单板中进行。稳定步骤后需要洗涤三次。这种特定的方案能够在室温下孵育后检测未裂解的细胞和内源蛋白，同时保持稳定的 HTRF 质量。
使用 HTRF 试剂检测 B-arr2 招募可以在用于培养、刺激、稳定和检测的单板中进行。稳定步骤后需要洗涤三次。该特定方案能够使用非裂解细胞和内源蛋白进行检测，同时在室温下孵育后保持稳定的 HTRF 质量。
B-arr2 招募测定方案的选项 2 通过在室温下 ON 孵育后去除 80μL 检测试剂来改善 S/B。
将 Tag-lite SNAP-Beta2R 和 SNAP-V1AR HEK293 细胞以 100,000 个细胞/孔接种在 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小时。随后在室温下处理 5 分钟（加压素 V1A 受体）和 30 分钟（β2 肾上腺素能受体），分别增加稀释在刺激缓冲液 4 中的加压素 (V1AR) 和异丙肾上腺素 (Beta2R) 的浓度。接下来除去培养基。 。用 30 µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100 µl 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，添加 100 µl B-arr2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。
按照类似的方案，通过在室温下分配逐渐增加浓度的 SR 49059 (V1AR) 和 ICI-118,551 (Beta2R) 30 分钟，然后添加 15nM（加压素）和 40nM（异丙肾上腺素）激动剂化合物来表征拮抗剂化合物。
将 Tag-lite SNAP-Beta2R HEK293 细胞以 100,000 个细胞/孔接种到 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小时。在室温下用稀释在刺激缓冲液4中的浓度逐渐增加的一组激动剂化合物处理30分钟后，除去培养基。用 30 µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100 µl 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，加入 100 µl B-arr2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。
按照类似的方案，一组拮抗剂化合物的特征是在室温下分配浓度不断增加的拮抗剂 30 分钟，然后添加 30nM 的异丙肾上腺素。
将 Tag-lite SNAP-GLP1R HEK293 细胞以 100,000 个细胞/孔接种到 96 孔板中，并在 37°C、5% CO2 下孵育 24 小时。用刺激缓冲液4中稀释的浓度逐渐增加的Exendin-4在室温下处理30分钟后，除去培养基。用 30 µL 稳定缓冲液 1 在室温下稳定细胞 15 分钟，然后用 100 µl 洗涤缓冲液 1 洗涤 3 次。最后，加入 100 µl B-arr2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号（测定方案选项 1）。
过夜孵育后执行额外步骤，除去 80μL 检测试剂（测定方案选项 2）。使用与测定方案选项 1 相同的读板器设置记录改进的 HTRF 信号。
B-抑制蛋白通过调节激动剂介导的 GPCR 信号传导在 GPCR 信号传导途径中发挥核心作用。它们的作用包括介导受体脱敏和再敏化过程，充当 MAPK1/3 或 AKT1 等 MAPK 通路的信号支架，并参与泛素蛋白连接酶向受体的募集。β-抑制蛋白作为多价接头蛋白起作用，可以将 GPCR 从 G 蛋白信号传导模式（从质膜传输短暂的信号）切换到 β-抑制蛋白信号传导模式，该模式传输一组不同的信号，起始为受体内化并穿过细胞内区室。
在 GPCR 脱敏过程中，B-抑制蛋白与 GRK 磷酸化受体结合，并在空间上阻止其与 G 蛋白的偶联。
然后，B-抑制蛋白通过与 AP2 复合物的 β-适应素亚基相互作用，靶向网格蛋白包被的凹坑中的许多受体进行内化，从而将 GPCR 募集到多部分复合物中。B-arrestin 和 AP2 之间的相互作用是在激动剂刺激后将 GPCR 定位在网格蛋白包被的凹坑内的核心初始步骤，因此针对这种相互作用的药理学化合物引起了相当大的兴趣。
内化的抑制蛋白受体复合物运输至细胞内内体。
然后，受体重新敏化需要去除受体结合的抑制蛋白，以便受体可以去磷酸化并返回质膜。β-抑制蛋白参与的程度似乎根据受体、激动剂和细胞类型而显着变化。
提供商 |
上海牧荣生物科技有限公司 | 下载次数 |
18次 |
资料大小 |
1.2MB | 资料类型 |
PDF 文件 |
资料图片 |
-- | 浏览次数 |
455次 |
5
立即询价
您提交后，专属客服将第一时间为您服务