人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)ELISA试剂盒实验使用说明书

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　　人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)ELISA试剂盒的实验使用说明书如下：

　　一、实验目的

　　本试剂盒用于检测人血清、血浆及相关液体样本中人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)水平。

　　二、实验原理

　　本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)测定标本中人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物。经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中pANCA的含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)的存在与否。

　　三、样本处理

　　‌血清‌：室温血液自然凝固10~20分钟，离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　‌血浆‌：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10~20分钟后，离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

　　‌尿液‌：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

　　‌细胞培养上清‌：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2~7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

　　‌组织标本‌：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2~8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000~3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

　　四、实验步骤

　　‌编号‌：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)。

　　‌加样‌：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。

　　‌温育‌：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　‌配液‌：将30倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用。

　　‌洗涤‌：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　‌加酶‌：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　‌温育‌：操作同3。

　　‌洗涤‌：操作同5。

　　‌显色‌：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

　　‌终止‌：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

　　‌测定‌：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　五、结果判定

　　‌试验有效性‌：阳性对照孔平均值≥1.00;阴性对照平均值≤0.10。

　　‌临界值(CUT OFF)计算‌：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。

　　‌阴性判定‌：样品OD值<临界值(CUT OFF)者为抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)阴性。

　　‌阳性判定‌：样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为抗中性粒细胞核周抗体(pANCA)阳性。

　　六、注意事项

　　操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

　　试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15~30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　底物请避光保存。

　　试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm。

　　所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。

　　七、保存条件与有效期

　　‌保存条件‌：2~8℃低温冷藏。

　　‌有效期‌：6个月。

　　请严格按照说明书进行实验操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。