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简述重组人EGF的制备方式
2024-8-26 阅读(201)
重组人EGF的制备方式涉及基因工程、蛋白质表达及纯化技术。在现代生物工程领域，重组人EGF的制备主要通过大肠杆菌等表达系统实现。这一过程包括基因合成、构建表达载体、转化宿主细胞、诱导表达以及蛋白纯化等关键步骤。具体介绍如下：
1.表达系统的选择和基因合成：
表达系统选择：常用于生产重组人EGF的表达系统是大肠杆菌（Escherichia coli），这是因为其具有快速生长、操作简单、成本低廉等特点。
基因合成与克隆：人工合成人EGF基因或者从人类基因组中提取EGF基因，然后将其插入到合适的表达载体中，这些载体通常会引入特定的标签序列（如His标签），以便后续的纯化工作。
2.融合蛋白的表达及纯化：
融合蛋白表达：为了增强EGF的可溶性和简化纯化流程，通常会将EGF基因与某种融合标签（如SUMO蛋白）结合表达为融合蛋白。这种融合蛋白可以提高目标蛋白的稳定性并降低被宿主细胞内蛋白酶降解的风险。
蛋白纯化：利用融合标签与金属离子的亲和性，通过亲和层析方法（例如镍柱亲和层析）来纯化融合蛋白。然后通过特定的蛋白酶识别位点将融合标签与EGF切割分离，从而得到高纯度的EGF蛋白。
3.蛋白折叠和活性检测：
蛋白重新折叠：由于大肠杆菌表达系统缺乏真核生物的蛋白折叠机制，因此重组蛋白通常以包涵体形式存在。需要通过重新折叠的过程，使人EGF恢复其天然构象和生物活性。
活性检测：采用生物活性测定方法（例如，利用Balb/C 3T3小鼠胚胎成纤维细胞进行细胞增殖试验）来验证人EGF的生物活性，确保其具备正常的生物学功能。
4.蛋白的保存和包装：
保存条件：纯化后的重组人EGF一般保存于-20℃以下的环境中，以防止蛋白质降解或失去活性。
产品包装：根据实际用途进行分装，并确保全程无菌操作，以免污染。
