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加菲说检测｜支原体NAT检测方法验证（六）
2021-7-30 阅读(1513)
近些年，生物制药迅猛发展，法规要求“源于细胞培养的产品都必须确保无支原体污染"，制药企业对支原体检测越来越重视。
在快速检测方法出现以前，传统检测方法时效性不足，因此只能“抓头"和“顾尾"，但行业内在注重支原体检测方法性的同时，对时效性的要求越来越高。如第四期所述：传统的培养法和DNA染色法虽然有着自身的优点，但较长的检测周期或灵敏度逐渐不能满足行业快速发展的需求。
NAT方法从当前支原体快速检测方法中脱颖而出，已经被美国药典[1]、欧洲药典[2]和日本药典[3]收录，并明确提到NAT方法在经过适当验证后，可用于检测方法补充或替代药典方法进行放行检测。国内的相关机构和也在这方面做了的研究工作。
此外，任何一种检测方法的验证都需要建立在方法适用性和方法优化的基础之上。支原体检测方法在IND阶段和临床阶段没有要求必须做到完整的验证，但是BLA前必须做面验证[9]。
需要强调一点，不管是欧洲药典还是日本药典，对NAT方法验证都有提到：标准品可以是支原体菌株也可以是支原体核酸。
支原体核酸能够被检出。这一方面数据可由厂家提供证明也可以根据实际情况进行选材验证；
非支原体DNA不会被检出。一般选用系统发育关系比较近的革兰氏阳性细菌来验证，包括Clostridium（梭菌属）, Lactoacillus（乳酸菌属）和Streptococcus（链球菌属）的细菌。但是在实际操作中，也会引入宿主细胞和实验室常使用的表达菌株DNA进行专属性验证，以确认细胞基质不会干扰结果判定。此外，由于支原体检测实验和操作环境都有的人源DNA气溶胶存在，因此，也建议引入人源DNA进行专属性确认，来排除检测结果假阳性。
检测限
检测限指能够检测到的样品中的The Lowest目标支原体或核酸浓度，在设定浓度情况下进行阴性/阳性确认即可，不要求定量。从统计学角度要求95%检测孔中能够检测为阳性的The Lowest支原体或拷贝数浓度即检测限。
药典NAT方法验证中但是不限于使用如下支原体进行方法学验证，包含了制药领域原辅料、操作人员等潜在污染源的代表性支原体类型。
实际验证中，一般建议选取自己工艺中可能引入的支原体类型进行验证即可
如工艺中涉及血清使用，建议验证精氨酸支原体和发酵支原体；
如果涉及贴壁细胞培养和胰酶使用，建议验证猪鼻支原体；
如果涉及植物源原辅料，建议进行柑橘顽固病螺原体验证；
生产工艺中人一直会参与实验操作，因此口腔支原体、肺炎支原体和唾液支原体都建议做验证。
对于每种支原体，需要在不同天，至少各做3个稀释梯度的标准品，每个稀释梯度做8个重复检测或不同天各做 4个稀释梯度，每个稀释梯度做6次重复检测，每个梯度的复孔数不低于24孔，以便统计学分析，并以95%阳性率结果进行检测限确定。也可以进行前期摸索，确定一个大致阳性阈值点，然后在此浓度范围附近进行检测限确认，进而减少工作量。
耐用性
耐用性指当检测方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。耐用性的评估在方法开发阶段就应该被考虑，比如试剂中Mg2+、引物和dNTP的浓度，核酸提取步骤的变动以及不同核酸扩增仪也是经常用来评估的对象。与此同时，也建议耐用性考察尽量包括样品保存方式，以及不同人员操作数据，来尽可能的减少检测偏差。
以上为支原体检测方法的验证内容。要替代药典方法，还需要做灵敏度可比性研究，证明NAT方法的灵敏度不低于药典现有方法，即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的灵敏度。有两种方案可以用于可比性研究：
核酸检测与药典方法平行进行，检测并分析支原体LOD浓度情况下的检出率；
将NAT方法的数据与此前药典方法验证的灵敏度数据对比。此种情况下，所用标准品的标定及稳定性都需要有明确的文件支持。
支原体NAT方法作为定性检测，其验证内容相对定量检测方法验证来说较为简单。但是从实质上看，验证复杂程度更大，而且考虑到标准品的来源、标定、保存及稀释检测，本身就是一项复杂工作。
但是就像前面内容所提到，支原体NAT方法本来就不能追求一次性完成，在BLA前完成完整验证即可。而且，支原体检测的本质是尽早尽可能灵敏的发现污染，这种检测不是通过一次性验证能够完成的，这是一项持续的过程，直到工艺步骤全部锁定。
目前为止，已经有很多企业使用MycoSEQ完成了NAT的方法验证工作，并已经用于产品的放行检测。因此为MycoSEQ的使用积累了宝贵的经验和实践基础。
