胡桃源性成分探针法荧光定量 PCR 试剂盒说明书

使用方法：

测定法的灵敏度来自作为报告的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 24 μ g/ml    5 号标准品 150 μ l 的原倍标准品加入 150 μ l 标准品稀释液

12 μ g/ml    4 号标准品 150 μ l 的 5 号标准品加入 150 μ l 标准品稀释液

6 μ g/ml     3 号标准品 150 μ l 的 4 号标准品加入 150 μ l 标准品稀释液

3 μ g/ml     2 号标准品 150 μ l 的 3 号标准品加入 150 μ l 标准品稀释液

1.5 μ g/ml   1 号标准品 150 μ l 的 2 号标准品加入 150 μ l 标准品稀释液

2. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50 μ l ，待测样品孔中先加样品稀释液 40 μ l ，然后再加待测样品 10 μ l （样品终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 |

3. 温育：用封板膜封板后置 37 ℃温育 30 分钟。

4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 μ l ，空白孔除外。

7. 温育：操作同 3 。

8. 洗涤：操作同 5 。

9. 显色：每孔先加入显色剂 A50 μ l ，再加入显色剂 B50 μ l ，轻轻震荡混匀， 37 ℃避光显色 15 分钟 .

10. 终止：每孔加终止液 50 μ l ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

胡桃源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒 荧光定量 PCR 检测方法包括以下步骤：

(1) 将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；

(2) 待测样本与步骤 (1) 所述标准品经同步进行实时荧光定量 PCR 扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中步骤 (1) 为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。

其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，地为 RPPH1 的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为 PCR 克隆载体，地为 TA cloning 载体，所述 TA cloning 载体较佳地为 pMD18-T 载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO:6 所示。所述的等比例较佳地为 1 ： 1 。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为 1:1 ，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高 HER2 基因扩增检测的可靠性。

步骤 (2) 为：待测样本与步骤 (1) 所述标准品经同步进行实时荧光定量 PCR 扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。

其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为 HER2 基因的扩增区域，所述荧光定量 PCR 扩增为本领域常规荧光定量 PCR 扩增方法，所述荧光定量 PCR 扩增方法较佳地为多通道荧光定量 PCR 扩增，更佳地为双通道荧光定量 PCR 扩增。

胡桃源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒 实验规则：

1 、要保证移液枪的准确性，误差不能超过 2% 。可用水和电子天平进行确定。但有专业人员进行矫正。

2 、要配备 20ul 、 50ul 、 100ul 、 1000ul 和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。

3 、要在实验前 1 小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。

4 、实验时，要使底物避光保存。

5 、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。

6 、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。

7 、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。

8 、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动 30 秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。

9 、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。

10 、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。

实验注意事项：

1 ） RT-PCR 可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料，不同的样本有不同要求，实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况；

2 ）客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和 ID 号；

3 ）客户尽量不要提供 DNA 或 RNA 样品。

4 ）样本保存于液氮或干冰，也可以保存于 Trizol 液中。

实时荧光定量 PCR （ quantitative real-time PCR ， qPCR ）是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程， * 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量（包括 * 定量和相对定量）和定性分析。

主要服务： DNA 或 RNA 的 * 定量分析、基因表达差异分析、基因分型。

主要技术：引物设计、 RNA 提取、 cDNA 合成、 qPCR 。