第八章 抗体孵育

一抗孵育 (Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。 吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或  4 ℃在摇床上缓慢摇动孵育  1 ～ 2 小时。如果一抗孵育一 小时效果不佳，可以在  4 ℃缓慢摇动孵育一夜。（注意：抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和抗原结 合不充分，出现假阴性 ）。 回收一抗。然后加入  Western 洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤  5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤 液，洗涤  5-10 分钟。共洗涤  3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)

参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗。 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或  4 ℃在摇床上缓慢摇动孵育  1 ～ 2 小时。回收二抗。然后 加入  Western 洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤  5-10 分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤  5-10 分钟。 共洗涤  3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前  2 步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一 定要干净。洗涤液使用  TBST 或者  PBST ，其中的  Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同 时短时间多次的洗膜（如  5-6 次，每次  3 分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第  3 步  TBS 洗涤是为了洗去膜上的  Tween-20 ，因为它可以阻碍底物的沉积。

注意事项

1. 抗体保存注意事项：

收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！

对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20 ℃ 。

分装的量以一次实验用完为好，zui少不能少于  10 ul 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可 能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在  40 ℃，避免再冻起来！

避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

大部分抗体收到后  40 ℃短暂保存  1-2 周对抗体活性是没有影响的。 长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染。

2. 一抗 / 二抗使用问题：

一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择zui适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背 景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二 抗的匹配。

3. 天然和非还原样品问题：

有些抗体只能识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空 间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态（抗体说明书中会有特殊说明）。对于 这些样品，缓冲液和凝胶中就不能含有  SDS ，并且不能够对蛋白进行加热变性。 有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类样品，就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂  DTT 和  beta- 巯基乙醇去除。