第六章 蛋白转膜

6.1 转膜的定义

将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如  NC 膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和 电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理*相同，只是用于固定胶 / 膜叠层和施加电 场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

6.2 转移膜的选择

杂交膜的选择是决定  Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小 等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于  Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（ NC ） 和 PVDF 膜。 NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白 质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱 下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的  NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量 蛋白的结合就越牢固。通常用  0.45 μm 和  0.2 μm 两种规格的  NC 膜。大于  20 kD 的蛋白可用  0.45 μm 的膜， 小于  20 kD 的蛋白就要用  0.2 μm 的膜了，如用  0.45 μm 的膜就会发生“ Blowthrough "的现象。 PVDF 膜灵 敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但  PVDF 膜在使用之前必需 用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒 钟。

zui 常 用 于 Western Blot 的转移膜主要是 硝 酸 纤 维 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜， 此外也有用尼龙膜、 DEAE  纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和  NC  膜的 特点相似 , 主要用于核酸杂交。

硝酸纤维素（ nitrocellulose, NC ）膜： NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影 响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在  NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；  NC 韧性较差，易损坏。

聚偏二氟乙烯 (Polyvinylidene fluoride, PVDF) 膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜 上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

膜的选择主要根据：

膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦 截蛋白的大小）；

不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；

如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

6 .3 转膜步骤（以槽式湿转为例）

1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡  10 min 。

注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸  6 片，放入转移缓冲液中平衡  10 min 。如用  PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和  3-5 秒钟。

3. 装配转移三明治：海绵 /3 层滤纸 / 胶 / 膜 /3 层滤纸 / 海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。

切记：胶放于负极面（黑色面）。

4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极， 100 V ， 1 h （电流约 为  0.3 A ）。

注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。

5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

6.4 转膜注意事项

1. 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移  buffer 浸泡  20min ；

a. 凝胶若是没在预冷的转膜  buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。

b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

2. 转膜顺序：阴极碳板 + 海绵 + 三滤 + 胶 + 膜 + 三滤 + 海绵 + 阳极碳板；

3. 转膜条件： 0.35 A/250 V/1 h/40 min/ 冰浴中进行转膜（转膜过程产生大量的热，注意冷却）；

（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）

4. 其它注意事项：

a. 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

b. 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶 / 膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不*。

c. 保证膜和滤纸的大小和凝胶*一样，过大和过小都会影响转膜效率。

d. 鸡来源的抗体与  PVDF 和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体

6.5 转膜后检测（此步可以省略）

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的  TBST （或  PBST ）中漂洗  1-2 分钟，以洗去膜上的转膜 液。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量zui大的  1-2 条带较难全部转到膜上。 转膜的效果也可以用丽春红染色液或硬度墨汁染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马 斯亮蓝快速染色液对完成转膜的  SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

a. 丽春红染色：蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。

b. 印度墨汁染色：只用于放射性标记抗体或放射性标记  A 蛋白探针的  Western 印迹过程。

印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。 这时，可改用其他检测方法或换用丽春红  S 。

注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。