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Incucyte® 与诺贝尔奖的故事｜靶向聚糖的肿瘤治疗篇
细胞表面糖基化是肿瘤转为恶性癌症的一个标志。特定蛋白质的糖基化会影响其结构稳定性和表达水平。细胞表面蛋白或脂质的唾液酸聚糖化通过多种机制抑制免疫激活并充当糖免疫检查点。其中唾液酸聚糖与唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素Siglec（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin）的相互作用，近期引起了科学家们的广泛关注。
Carolyn R. Bertozzi和K. Barry Sharpless获得了2022年诺贝尔化学奖，以表彰他们在发展点击化学和生物正交化学方面的贡献。他们利用点击化学开发了一些针对糖基化的靶向药物，在研究中他们都用了活细胞实时成像系统Incucyte®！
2022年诺贝尔化学奖Carolyn R. Bertozzi
靶向降解唾液酸聚糖【1】
抑制型Siglec与PD-1类似，其胞内端含有免疫受体酪氨酸抑制结构域（ITIM），能够募集磷酸水解酶SHP1/2。研究表明，肿瘤细胞表面蛋白或脂质的唾液酸聚糖化通过唾液酸聚糖与Siglec信号通路发挥免疫抑制功能，而唾液酸酶可以清除这些唾液酸聚糖。基于此，研究者利用生物正交反应构建了以肿瘤特异性的方式靶向降解唾液酸聚糖的生物制品——曲妥珠单抗（靶向HER2阳性肿瘤）-唾液酸酶偶联物T-Sia 2（下图d）。T-Sia 2抑制肿瘤生长，增强免疫细胞浸润，并延长曲妥珠单抗抵抗小鼠的生存周期。
文章使用Incucyte®检测曲妥珠单抗与唾液酸酶之间连接子（Linker）的稳定性。研究者将荧光素AF647标记连接子（oxime和HIPS）-抗体的偶联物（下图a），加入到HER2阳性的细胞培养体系里，并在培养箱内进行连续4天的实时成像。通过检测并定量细胞上偶联物的总荧光强度随时间的改变，定量结果可以体现该偶联物随时间的内化、降解（图c）和长时程稳定性（图d和e）。结果发现HIPS-曲妥珠单抗偶联物更稳定。
a. AF647标记两种连接子-抗体的偶联物，与人血浆在37度孵育两天后trastuzumab-HIPS的水平更高，与HCC-1954细胞孵育1h后，换成正常培养基，trastuzumab-HIPS内化幅度更高，之后均被酶解随时间荧光信号降低（图c），如在培养基内加入蛋白酶抑制剂来抑制酶解，trastuzumab-HIPS信号可以保持长时程稳定（图d），如孵育后固定两种耦联物信号均可保持长时程稳定（图e）。
Incucyte®成像组件就置于培养箱内，想拍摄多久就拍摄多久。
2022年诺贝尔化学奖K. Barry Sharpless
靶向降解Siglec-7/9【2】
Siglec-7/9在肿瘤浸润的髓系细胞上表达水平很高，虽然T细胞内Siglec的转录本只是基础水平，但它可以从肿瘤微环境内发生相互作用的髓系细胞上通过胞吞作用获取Siglec-7/9。后者使T细胞受体TCR相关信号通路去磷酸化，从而抑制T细胞功能。使用氟化硫交换（SuFEx）点击化学，研究者开发了可以与Siglec-7/9以高特异性、高亲和力结合的配体，并在该配体的基础上构建了Siglec-7/9 的降解剂——Sig7/9de。该降解剂借助细胞膜上的甘露糖-6-磷酸受体（M6PR）将Sigle内化到溶酶体内，以不可再循环的方式被降解（下图g）。Western Blot和流式检测结果表明Sig7/9de可以诱导T细胞和髓系细胞膜上Siglec高效的降解。
野生型（EV P14）T细胞对B16-GP33肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，Siglec-7/9均高表达T细胞（Siglec-7/9+ P14）的杀伤作用减弱，如在杀伤体系中加入Sig7/9de，其对肿瘤细胞的杀伤能力恢复（下图h）。
g. Sig7/9de降解试剂作用模式图；h. B16-GP33肿瘤细胞表达GFP，加入不同处理的P14 T细胞，利用Incucyte® 间隔3h实时成像检测48h，以各组GFP阳性靶细胞数量与单靶细胞组细胞数的比值来定量各时间点T细胞的杀伤作用。
实时定量曲线直观显示效应细胞什么时间点开始杀伤靶细胞，以及各组T细胞杀伤速度和强度的差异，定量结果的error Bar值很小，说明Incucyte®群体定量的重复性很好。后两篇文章还用赛多利斯的另一款产品Octet®非标记分子互作系统检测设计的生物药物和靶点的亲和力。
Incucyte®有什么优点呢？
培养箱内自动进行长达数周的连续观察，周末节假日也在采集数据，减少人力，提高实验效率
组间样本连续成像时样品板不动，不影响效应细胞与靶细胞的相互作用，聚焦稳定，结果更客观
多个板位可分别独立设置检测程序，兼容各种多孔板和培养皿，通量高
具有划痕、肿瘤球、类器官，趋化、血管生成等多个软件模块，提高分析效率
向导式软件设置，简化成像、数据分析和图片、视频导出流程，是真正可以用起来的设备
大于60种优化过的详尽的Protocol，提高实验效率
用户群广，应用文献数大于18,000篇，认可度高
只要放好您的细胞，其他交给Incucyte®吧！跟随诺贝尔奖获得者的脚步用Incucyte®发好文章吧！
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Incucyte®长时程活细胞成像系统 应用文集
-参考文献-
【1】Gray, M.A., Stanczak, M.A., Mantuano, N.R. et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nat Chem Bol 16, 1376–1384 (2020)
【2】Wang C, Hou Y, Zak J, Zheng Q, McCord KA, Wu M, Zhang D, Chung S, Shi Y, Ye J, Zhao Y, Hajjar S, Wilson IA, Paulson JC, Teijaro JR, Zhou X, Sharpless KB, Macauley MS, Wu P. Reshaping the tumor microenvironment by degrading glycoimmune checkpoints Siglec-7 and -9. bioRxiv [Preprint]. 2024 Oct 12:2024.10.11.617879. doi: 10.1101/2024.10.11.617879. PMID: 39416090; PMCID: PMC11483058.