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超强CP，打开新型细胞疗法新格局
细胞治疗为疾病治愈提供了新的方法，给患者带来新的希望。然而，由于缺乏高度癌症特异性的表面标记物，细胞治疗在免疫治疗靶点的选择上面临挑战，并且在应用上有一定的局限性。首先，由于正常细胞也表达靶点，使得治疗中表现出显著毒性。其次，大多数与实体肿瘤相关的抗原属于胞内蛋白，很难被识别，所以对于大多数实体瘤，细胞治疗仍显得力不从心。
今天，陈老湿为大家推荐几篇近期发表的细胞治疗相关文章，这些研究在一定程度上提出了解决上述问题的方法。当然，这些文章均在研究过程中使用了赛多利斯的 Octet® 非标记分子互作系统 和 Incucyte® 实时活细胞分析系统 ，让我们一起来看看吧。
Octet®
Incucyte®
Nature Cancer
崭新的方法发现更特异的肿瘤标志物！[1]
研究人员在美国加州大学旧金山分校开发了一种新方法，他们首先使用化学交联剂将细胞表面的蛋白连接在一起，这一步骤可以在原位“冻结”蛋白质的自然构象，并保留其相关的结构信息。然后，他们对这些蛋白进行糖蛋白氧化和生物素化处理，由于生物素与链霉亲和素有很强的结合能力，利用这种蛋白富集方法，研究人员成功地增加了对肿瘤相关肽的质谱覆盖。这项研究发现，整合素β2的活化构象是急性白血病的一个标志物（图1）。
图1. 活性肿瘤表面抗原构象筛选策略
研究人员利用基于完全人类框架序列的抗原结合片段（Fab）噬菌体展示平台，对重组整合素β2抗体进行筛选（图2）。他们从约1010个候选结合物库中，确定了10个与整合素β2有结合作用的候选物（Hit），其中5个通过基于生物层干涉技术（BLI）的Octet® 进行验证，确定能与活性整合素β2结合，其中编号7065#Hit最强。
图2. 展示筛选与活性整合素β结合的Fab片段：左图为嵌合抗原受体（CAR）筛选过程；右图为Octet® 检测的亲和力结果
基于7065#抗体，研究人员筛选设计CAR-T细胞，并使用Incucyte® 评估了对肿瘤细胞的杀伤活性和T细胞增殖活性。结果显示，针对活性整合素β2（aITGB2）的CAR-T细胞在杀伤活性上优于传统的针对CD33的CAR-T细胞，同时也保持了T细胞的增殖活性。
图3. Nomo1细胞被标记mCherry，而CAR-T细胞则被标记GFP，y轴代表通过荧光强度检测细胞增殖的情况（mCherry上图，GFP下图）；在1:1的效应-肿瘤（E:T）比例下，aITGB2 CAR-T细胞毒性水平与cd33 CAR-T细胞相似（左上）；在1:10的E:T比例下，aITGB2 CAR-T细胞表现优于抗cd33（右上）；两种CAR-T细胞在共培养实验中表现出相似的增殖（下面两幅图）；使用Incucyte® 实时活细胞分析系统，每4个小时自动拍摄一次，并计算mCherry和GFP荧光
本文验证了一种潜在的系统性方法来识别和靶向癌症中的构象特异性抗原，基于活化整合素的CarT疗法，值得在AML中进行进一步的临床前评估，并为结构导向免疫治疗靶点的其他应用提供了途径。
Nature
新型针对实体瘤的细胞治疗法[2]
实体肿瘤靶点蛋白的降解片段，可以通过主要组织相容性复合体（MHC） 呈递到肿瘤细胞表面，并被免疫系统识别，从而杀伤肿瘤细胞。美国费城儿童医院的研究人员非常巧妙地选择了很难通过蛋白突变找到治疗靶点的神经母细胞瘤作为研究对象，筛选出了特异存在于肿瘤细胞表面的多肽。以这些多肽为靶点，他们开发了一种新型的嵌合抗原受体CAR-T治疗，并命名：PC-CAR（“Peptide-centric” Chimeric Antigen Receptors，多肽中心嵌合抗原受体）。将MHC分子结合的多肽通过类似Pull-down的方法富集，然后用质谱的方法进行鉴定，然后通过大型基因组数据进行分析对比和亲和力预测，研究人员确定了一种未突变的神经母细胞瘤肽，它源自PHOX2B（一种神经母细胞瘤依赖性基因和转录调节因子）。以这个多肽为靶点，使用噬菌体展示的方法筛选出了特异性的ScFv作为CAR，名字为10LH，使用Octet®测得其与PHOX2B亲和力为13nM。
图4. 左图为PC-CAR示意图，当中红色为呈递的抗原；
右图使用Octet® 固化10LH，与多肽进行结合解离；kd=76×10−4/s，KD=13 nM，而另外一种ScFv 302LH的解离速率较快，亲和力较低
接下来就是以免疫细胞杀伤为主的功能实验，而在这篇文章中这个实验的主力就是Incucyte® 实时活细胞分析系统。在杀伤实验中，加入Caspase 3/7 红色荧光染料，靶点细胞（肿瘤细胞）带GFP绿色荧光，使用Incucyte® 实时计算红色荧光面积和绿色荧光面积。红色荧光面积升高快，绿色荧光下降快，则代表杀伤效果越大。
图5. Incucyte® 实时活细胞成像：a左图为PC-CAR对SKNAS胶质瘤细胞（呈递PHOX2B）的杀伤作用明显，a右图为PC-CAR对其他肿瘤细胞（不呈递PHOX2B）的杀伤则不明显；b图从靶细胞动态增殖水平来观察，发现PC-CAR对SKNAS等胶质瘤细胞的杀伤作用明显
J Immunother Cancer
CAR亲和力并不是越高越好！[3]
大约50%接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的患者会出现复发，因此，迫切需要开发新的免疫治疗靶点。最近有研究发现，CD72是B细胞恶性肿瘤中一个很有潜力的新靶点。之前发现的针对CD72的羊驼来源的纳米抗体（NbD4）虽然有效，但是效果不及传统的针对CD19的CarT。因此，以NbD4为母本进行人源化，产生一系列新的CD72纳米抗体。将这些纳米抗体插入第二代 CD72 CAR-T 细胞中，并在体外和体内针对 B 细胞急性淋巴细胞白血病和 B 细胞非霍奇金淋巴瘤的临床前模型进行评估。其中一种抗体克隆（H24）显示出对B细胞肿瘤有着增强的杀伤效力，这也包括CD19 CAR-T复发后的患者来源样本。H24 对 CD72 的结合亲和力适中，而进一步的提高亲和力（KD<1nM）却不会导致细胞毒性的增强。
图6. Octet® 结果显示：H24亲和力高于母本NbD4，主要是解离速率常数Koff变小
图7. Incucyte® 结果显示，H24在增加肿瘤细胞杀伤的同时（左图），保持了T细胞的增殖活性（右图）
图8. 对H24进行亲和力成熟并提高亲和力的抗体NbD4.7,NbD4.13（左图），并没有增加对肿瘤细胞的杀伤活性
为什么细胞治疗研究要用
Incucyte® 实时活细胞分析系统呢？
培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；只要放好您的细胞，其他交给Incucyte® 吧
6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高
高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文提到了使用Incucyte® 多个参数的监控，使得结果更加准确
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol，文章数大于12,000篇
为什么要用Octet® 呢？
非标记Direct Binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好的保持反应物的活性
快速测定亲和力，提供结合速率常数和解离速率常数更加定量化地表征分子互作
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
写入了美国药典，文章>12000篇，认可度广
万金油技术，可以用于检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子
操作简便，耗材及维护成本低
在赛多利斯的Octet® 分子互作分析系统和Incucyte® 实时活细胞成像这对CP的助力下，相信有更多的新型细胞治疗法产生！
实时活细胞分析开启免疫细胞杀伤实验新格局
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-参考文献-
[1] Mandal, K., Wicaksono, G., Yu, C. et al. Structural surfaceomics reveals an AML-specific conformation of integrin β2 as a CAR T cellular therapy target. Nat Cancer 4, 1592–1609 (2023).
[2] Yarmarkovich, M., Marshall, Q.F., Warrington, J.M. et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature 623, 820–827 (2023).
[3] Temple WC, Nix MA, Naik A, et al. Framework humanization optimizes potency of anti-CD72 nanobody CAR-T cells for B-cell malignancies. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2023;11:e006985. doi:10.1136/jitc-2023-006985